小G蛋白R(shí)an與GlyRS相互作用調(diào)控乳蛋白合成的初步研究.pdf

1、乳蛋白合成的機(jī)理是重要的生命科學(xué)基礎(chǔ)問題之一，近年來的研究已有一些明顯的進(jìn)展。細(xì)胞核和細(xì)胞液之間如何應(yīng)答氨基酸信號(hào)從而調(diào)節(jié)乳蛋白的合成，仍是現(xiàn)今泌乳生物學(xué)領(lǐng)域尚待解決的重要科學(xué)問題。Ran作為一個(gè)重要的細(xì)胞增殖因子，在多種細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮作用，包括DNA復(fù)制，細(xì)胞核膜重建，紡錘體的形成，物質(zhì)的核漿轉(zhuǎn)運(yùn)等。國內(nèi)外關(guān)于Ran基因與甘氨酰tRNA合成酶在奶牛乳腺發(fā)育過程中表達(dá)及相互作用的研究鮮有報(bào)道。本研究以泌乳期奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型。探索R

2、an基因與甘氨酰tRNA合成酶的相互作用，在奶牛乳腺中的調(diào)節(jié)作用，為動(dòng)物乳腺發(fā)育和泌乳調(diào)節(jié)機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)資料，為人工調(diào)節(jié)乳品質(zhì)和乳產(chǎn)量提供理論依據(jù)。
　　本研究以中國荷斯坦奶牛作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用組織塊培養(yǎng)法，培養(yǎng)并純化體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，用蛋白質(zhì)免疫印記（WB）和免疫熒光（IF）檢測(cè)細(xì)胞中角蛋白18（CK18）和酪蛋白（CSN2）的表達(dá)以鑒定細(xì)胞的純度和泌乳功能。實(shí)驗(yàn)通過在培養(yǎng)液中添加0.6 mmol/L的蛋氨酸，建立

3、了細(xì)胞的泌乳模型。檢測(cè)添加蛋氨酸泌乳模型中，Ran過表達(dá)后GlyRS的表達(dá)顯著上升（p<0.01）。
　　以體外培養(yǎng)的泌乳期奶牛乳腺上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，采用共定位技術(shù)初步檢測(cè)Ran與GlyRS是否相互作用，采用Western blotting技術(shù)探索在泌乳過程中Ran的與GlyRS成正相關(guān)。構(gòu)建重組質(zhì)粒PEX-7-Ran（Ran-RFP）和實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建成功的GlyRS-GFP，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，進(jìn)行熒光能量共振轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，用相關(guān)軟件