基于RNA測(cè)序技術(shù)的馬氏珠母貝珍珠囊轉(zhuǎn)錄組及數(shù)字基因表達(dá)譜分析.pdf

1、本文以我國(guó)海水珍珠的主要生產(chǎn)貝類(lèi)——馬氏珠母貝(Pinctada martensii)的珍珠囊為研究對(duì)象,構(gòu)建了1個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)和6個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的數(shù)字基因表達(dá)譜(Digital gene expression,DGE)文庫(kù),運(yùn)用新興的RNA高通量測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)對(duì)構(gòu)建的文庫(kù)開(kāi)展測(cè)序、組裝和生物信息學(xué)分析。同時(shí),利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(Real—time PCR,qRT-PCR)擴(kuò)增免疫和礦化相關(guān)基因在6個(gè)不同發(fā)育階段的表達(dá)

2、變化規(guī)律,以達(dá)到驗(yàn)證測(cè)序分析的目的。
　　 對(duì)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)測(cè)序,得到39,400,004條原始reads,總核苷酸數(shù)為3,546,000,360nt。其中,GC含量、Q20和未知堿基的百分比分別為42.94％、94.65％和0.01％。對(duì)原始reads進(jìn)行拼接組裝,得到102,762條Unigene,其中有46,387個(gè)功能完整的各種長(zhǎng)度編碼區(qū)域被識(shí)別,且這些Unigene編碼的蛋白大多數(shù)都超過(guò)了200個(gè)氨基酸。這些轉(zhuǎn)錄本中,大約

3、有23,081條Unigene可能參與了219個(gè)已知的代謝或信號(hào)通路。與Nr數(shù)據(jù)庫(kù)、Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)、GO分類(lèi)和COG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),分別有36,989、30,592、7,700和10,414個(gè)轉(zhuǎn)錄本被注釋或分類(lèi),COG分類(lèi)揭示有447個(gè)轉(zhuǎn)錄本的功能目前尚未被報(bào)道。已注釋的轉(zhuǎn)錄本中有453條Unigene與無(wú)脊椎動(dòng)物免疫基因相關(guān),103條與生物礦化基因相關(guān)。
　　 對(duì)珍珠囊發(fā)育第5、10、15、20、30和60天的DGE文庫(kù)

4、測(cè)序,得到的原始Tag均為5,000,000,去除雜質(zhì)標(biāo)簽后得到Clean Tag分布在250萬(wàn)到.340萬(wàn)之間,平均占總Tag數(shù)的94.91％；六個(gè)DGE數(shù)據(jù)庫(kù)能夠比對(duì)到轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的Clean Tag占總Clean Tag的26.32％,即在珍珠囊發(fā)育的6個(gè)時(shí)期中,一些高表達(dá)的基因在轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中沒(méi)有出現(xiàn)。珍珠囊發(fā)育的第5、10、15、20和30天的表達(dá)譜與第60天的相比,分別有2192、1902、2108、1475和1368個(gè)差異

5、表達(dá)基因,尤其是在第15天差異表達(dá)基因數(shù)目有明顯增加的趨勢(shì)。與轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)比較分析發(fā)現(xiàn),在153條與免疫相關(guān)的Unigene中,30條在珍珠囊不同發(fā)育時(shí)期有顯著差異表達(dá)(P<0.05),它們分別編碼溶菌酶、Toll樣受體、堿性磷酸酶、清道夫受體、酸性磷酸酶和凝集素等蛋白；在103條與生物礦化相關(guān)的Unigene中,13條在珍珠囊發(fā)育不同時(shí)期有顯著差異表達(dá)(P<0.05),它們分別編碼皮連蛋白、酪氨酸類(lèi)似蛋白、perlwapin、鈣調(diào)素蛋白

6、家族等蛋白。
　　 從有顯著差異表達(dá)的Unigene中選擇與免疫和礦化相關(guān)的基因各一個(gè),進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,溶菌酶基因在珍珠囊發(fā)育前30天的表達(dá)水平處于較低的水平,在第30天表達(dá)顯著上調(diào),然后開(kāi)始下調(diào),第60天時(shí)表達(dá)水平基本恢復(fù)到原來(lái)狀態(tài)。皮連蛋白基因在珍珠囊發(fā)育的前20天沒(méi)有明顯的差異表達(dá),第30天時(shí)該基因發(fā)生顯著上調(diào),直到第60天該基因的表達(dá)基本保持了較高的水平。熒光定量對(duì)這兩個(gè)基因表達(dá)的分析結(jié)果與DGE檢