銀杏轉錄組測序及葉片與胚珠數字基因表達譜分析.pdf

1、胚珠是種子植物最重要的生殖結構，在其生命周期和世代交替過程中起到關鍵作用。目前被子植物胚珠發(fā)育的分子遺傳機理已被廣泛研究，而裸子植物胚珠的相關研究卻非常有限。銀杏作為現存最古老的裸子植物之一，已有形態(tài)學與解剖學研究表明銀杏胚珠的生殖結構與功能具有早期種子植物很多原始特征，此外，在少量現存銀杏與古生代銀杏類植物中，發(fā)現銀杏胚珠還具有葉生擬胚珠的形態(tài)特征。因此，從基因組水平上系統(tǒng)研究銀杏胚珠的發(fā)育機制具有重要的科學價值。前人有關銀杏的分子水

2、平研究主要僅集中在次生代謝物合成及系統(tǒng)發(fā)育與進化等方面，而從基因組水平上對銀杏胚珠與葉片之間共性表達及差異表達的功能基因系統(tǒng)比較研究未見報道。本研究利用第二代高通量測序技術結合生物信息學分析的方法對銀杏雌葉轉錄組進行測序分析，并對銀杏胚珠與葉片進行數字基因表達譜的比較與分析，確定了大量共同表達與差異表達的功能基因以及與胚珠發(fā)育相關基因，主要研究結果如下:
　　(1)應用改良后的CTAB法分別成功提取銀杏葉片與胚珠的總RNA，質檢合

3、格后，被用于轉錄組及數字基因表達譜測序。
　　(2)基于Illumina High-seqTM2000測序平臺對銀杏葉片進行轉錄組測序，總共獲得了56，341，460個raw reads，經過去除低質量的序列，接頭序列，含N的比例大于5％的序列獲得54，253，512個clean reads，Q20高達97.21％，測序質量高。De novo組裝最終獲得77，898個平均長度高達829 bp，N50為1743bp的unigenes

4、，豐富了銀杏轉錄組信息。
　　(3)經BLASTx將所有unigenes比對到6大數據庫中，總共有42，624條unigenes得到了基因功能注釋，占所有unigenes總量的54.72％。經KEGG數據庫功能注釋結果，代謝途徑分析顯示共有1859個unigenes被注釋到18種主要的次生代謝物生物合成途徑當中，其中獲得可能參與銀杏類黃酮合成的90個unigenes(編碼11個關鍵酶)。此外還獲得參與銀杏萜內脂生物合成的61個un

5、igenes(編碼17個關鍵酶)。根據Swiss-prot注釋結果，發(fā)現了855個unigenes編碼16類轉錄因子，可能參與了調控銀杏葉片生長發(fā)育和形態(tài)建成、次生代謝物合成、逆境脅迫等多個生物學過程;確定了許多與發(fā)育相關的候選基因。
　　(4)銀杏轉錄組測序獲得的unigene序列聯合已公布的銀杏轉錄本序列，共同組成100，124條參考序列供DGE測序與比對分析。經去除低質量的數據后，從銀杏葉片與胚珠DGE測序中分別獲得11，5

6、97，234和12，459，128條clean reads，完美比對上參考序列的clean reads分別達到80.21％與74.48％，表明比對結果好。測序飽和度及隨機性分布顯示測序質量較好。
　　(5)基因定量分析結果顯示了銀杏葉片與胚珠間存在42，149個共同表達的基因，分別有14，679個與6301個特異表達基因存在于葉片及胚珠中。在葉片中高度表達的基因編碼的蛋白可能參與植物防御和光合作用過程;在胚珠中高度表達的基因編碼了

7、的蛋白參與了細胞壁的合成，分泌作用及類黃酮合成等生物學過程。更重要的是，分析還確定了121與胚珠發(fā)育緊密相關的同源基因。
　　(6)對銀杏葉片與胚珠形態(tài)解剖結構觀察，葉脈呈二歧分枝狀與胚珠對生于單一短枝上的形態(tài)結構類似;葉片與胚珠都呈綠色，含有葉綠體;葉片與胚珠表面都分布大量氣孔，這些結果顯示葉片與胚珠形態(tài)與結構上具有許多相似的特征。在此基礎上，進一步從基因表達水平上分析確定許多參與氣孔發(fā)育、葉綠體發(fā)育及光合作用等光合過程中的共同

8、表達基因，并使用熒光定量實驗驗證測序結果的一致性，顯微觀察與功能基因表達證實銀杏胚珠與葉片一樣，也具有葉綠素合成、光合作用及氣體交換等生物學功能。
　　(7)經差異基因表達篩選，銀杏葉片與胚珠間差異表達基因共11，434條，其中葉片相對于胚珠有4575條基因上調表達，有6859條基因下調表達。通過差異基因GO功能顯著性富集分析，細胞分裂(GO∶0051301)，細胞分化(GO∶0030154)，DNA復制的起始(GO∶000626

9、1)，激素轉導(GO∶0009914)，花器官的形成(GO∶0048449)等terms被顯著富集;KEGG功能顯著性富集分析結果顯示38條pathways被顯著富集，主要包括代謝通路，次生代謝物合成，植物激素信號轉導等。這些顯著富集的GO terms和pathways中大部分DEGs是在葉片中呈下調趨勢，這些結果表明DEGs顯著富集的功能通路與葉片及胚珠的生長發(fā)育特點和進程有著緊密的協(xié)同性
　　(8)經聚類分析與高度差異表達基因