屋塵螨主要過敏原蛋白Derp2在大腸桿菌中可溶性表達與純化.pdf

1、目的:本研究旨在通過分子伴侶蛋白的協(xié)助實現(xiàn)屋塵螨主要過敏原Derp2的原核可溶性表達，獲得高純度、二級結構完整及具有與人血清IgE結合免疫活性的重組Derp2過敏原蛋白，為由屋塵螨引起的過敏性疾病的臨床診斷和免疫治療奠定實驗基礎。
　　方法:以pCold-TFM質粒（改造自pCold-TF原始質粒）為表達載體，將合成的Derp2成熟序列（GenBank登錄號：FM177223.1）插入pCold-TFM載體的BamHI和EcoRI

2、酶切位點之間以獲得pCold-TFM-Derp2重組質粒，轉化大腸桿菌表達菌株BL21（DE3），以IPTG在16℃條件下進行誘導表達。融合蛋白TF-Derp2通過鎳柱親和層析、凝膠過濾層析進行純化后，經(jīng)HRV-3C蛋白酶酶切去除TF融合標簽，獲得游離Derp2變應原蛋白。高純度的Derp2以陽離子交換層析方法獲得，通過SDS-PAGE、多角度激光光散射方法分析Derp2變應原蛋白的純度、溶液中聚合狀態(tài)及分子量大??；采用圓二色譜儀分析重

3、組 Derp2與屋塵螨培養(yǎng)基中提取的野生型Derp2(nDerp2)的二級結構的相似性，以dot-blot免疫學方法比較rDerp2和nDerp2對11例特應性皮炎患者(11例特應性皮炎患者均對屋塵螨提取物皮膚點刺試驗呈陽性反應)血清IgE結合活性的差異性。
　　結果:誘導表達后，重組TF-Derp2融合蛋白幾乎全部以可溶形式存在于菌體破碎物離心后的上清液中；純化1升大腸肝菌培養(yǎng)物可獲得5mg高純度的、可溶的rDerp2；rDer

4、p2蛋白在PBS緩沖液中以單體的形式存在，分子量大小為14.3 kDa；rDerp2與nDerp2的二級結構基本一致，并且兩者與特應性皮炎患者血清中IgE的結合活性基本一致。
　　結論:本方法體系通過TF融合表達可以獲得產(chǎn)量可觀、純度高、二級結構完整并具有良好IgE結合活性的可溶性屋塵螨主要過敏原Derp2，說明TF分子伴侶融合表達體系能促進目標蛋白Derp2的折疊、提高其可溶性及保持其免疫活性；此研究工作為重組屋塵螨過敏原Der