獨一味對兔骨關節(jié)炎模型關節(jié)軟骨影響的實驗研究.pdf

1、目的：探討藏藥獨一味對兔KOA模型軟骨退變的保護或治療機制,為臨床獨一味防治骨關節(jié)炎的推廣應用提供理論支持。
　　 方法：將40只新西蘭大白兔隨機編號,分為五組,即,(A)空白對照組、(B)模型對照組、(C)小劑量組治療組、(D)中劑量組治療組、(E)大劑量組治療組,每組8只。A組作為空白對照組,行模擬手術。B、C、D、E組按Hulth方法,制造兔膝關節(jié)骨關節(jié)炎模型。術后1周開始全部實驗動物每天驅趕行走30 min,于造模1周后

2、開始灌胃,各治療組給藥劑量根據(jù)Meeh-Rubner公式計算,將按體表面積折算的臨床常用量等效劑量,溶于10mL蒸餾水中,獨一味小劑量治療組、中劑量治療組和大劑量治療組分別灌胃給予獨一味膠囊60mg/kg、120mg/kg、240mg/kg。每天灌胃給藥一次;空白對照組、模型對照組于同一時間點給予等量生理鹽水灌胃。治療6周,末次給藥后禁食12 h。處死動物。再用組織學、免疫組化、RT-PCR學等技術對兔KOA模型關節(jié)軟骨、關節(jié)液等部位進

3、行檢測和評估。
　　 切開實驗側兔膝關節(jié),對兔膝關節(jié)關節(jié)軟骨行大體觀察并參照文獻標準進行評分,比較各組間的差異;將關節(jié)軟骨制作成普通光學顯微鏡切片進行觀察,并按照Mankin's關節(jié)軟骨組織學評分系統(tǒng)進行評分,比較各組間的差異;制作透射電子顯微鏡切片,觀察其超微病理變化。
　　 在切開膝關節(jié)之前抽取關節(jié)液,檢測關節(jié)液中IL-1β、NO的含量變化,比較各組間的差異;
　　 應用RT-PCR技術檢測藥物治療后,關節(jié)軟

4、骨MMP-3,MMP-13,TIMP-1mRNA表達的變化,比較各組間的差異;
　　 用免疫組化法分別測量關節(jié)軟骨組織GAG含量、Ⅱ型膠原陽性染色面積的變化,并比較各組間的差異:
　　 結果：給藥前后體重變化:與給藥前動物體重相比較,各劑量治療組在實驗結束時體重均有不同程度的增加,但無統(tǒng)計學差異(均為P＞0.05)。關節(jié)活動度:實驗動物關節(jié)被動活動度測定結果顯示,實驗6周時,模型對照組與小劑量治療組相比,P＜0.05。各

5、治療組關節(jié)活動度均有不同程度的恢復,獨一味中劑量、大劑量治療組恢復程度尤為明顯(P＜0.01)。
　　 大體觀察,中、大劑量治療組與模型對照組比較,軟骨磨損、退變程度明顯減輕(P＜0.01),光鏡下觀察,治療組與模型對照組比較,Mankin's評分明顯降低,小劑量治療組與模型對照組比較,P＜0.05;中劑量、大劑量治療組與模型對照組比較,P＜0.01;電鏡觀察發(fā)現(xiàn),藥物治療后中、大劑量治療組關節(jié)軟骨細胞的形態(tài)、結構、排列等均優(yōu)于

6、模型對照組。
　　 經(jīng)不同劑量獨一味治療后,各組關節(jié)液中的NO、IL-1βD含量均值相對于模型對照組有所降低,各治療組間進行比較,中、大劑量治療組關節(jié)液中NO、IL-1β含量與模型對照組比較明顯降低,比較有顯著性差異(P＜0.01)。小劑量治療組與模型對照組比較,經(jīng)檢驗,P＜0.05;提示隨著獨一味劑量的增大,關節(jié)液中NO、IL-1β含量進一步降低。
　　 治療后,中、大劑量治療組與模型對照組比較,中、大劑量治療組MMP

7、-3,MMP-13的mRNA表達較低、而TIMP-1的mRNA表達較高;模型對照組關節(jié)軟骨中MMP-3,MMP-13的 mRNA表達明顯增高,而TIMP-1表達明顯降低。組間比較有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 Ⅱ型膠原陽性染色后,模型對照組,陽性染色顯著減少,分布不均勻,且表淺層出現(xiàn)缺損;經(jīng)獨一味膠囊治療后,中、大劑量治療組與模型對照組比較,中、大劑量治療組Ⅱ型膠原陽性染色面積明顯增大,比較有顯著性差異(P＜0.01)。檢

8、測軟骨基質中GAG含量,模型組與小劑量治療組比較,軟骨基質中GAG含量有顯著性差異,P＜0.05;中劑量組治療組、高劑量組治療組與模型組分別比較,中、高劑量治療組軟骨基質中GAG含量有顯著性差異,P＜0.01;
　　 結論：
　　 1.Hulth手術方法建立家兔膝OA模型,穩(wěn)定性好,成功率高,誘導周期較短,重復性好。
　　 2.獨一味通過減少兔膝OA模型關節(jié)液中NO、IL-1β含量,抑制MMPs表達,增加TIMP

9、-1表達,提高ECM中GAG含量,促進Ⅱ型膠原的合成,延緩或一定程度上能夠阻止兔膝OA病變過程的發(fā)展,進而改善兔膝OA關節(jié)功能。
　　 3.獨一味膠囊對骨性關節(jié)炎的治療機制可能與這幾方面有關:
　　 在兔膝關節(jié)骨性關節(jié)炎模型上,經(jīng)不同劑量獨一味治療后,能增加模型OA關節(jié)的關節(jié)活動度,減輕或延緩軟骨退變、磨損程度和減少關節(jié)周圍軟骨性骨贅的增生,降低關節(jié)軟骨光鏡下的Mankin’s評分,中、高劑量治療組表現(xiàn)尤為明顯。

10、　　 應用獨一味干預OA關節(jié)模型后,經(jīng)檢測關節(jié)液中的NO、IL-1β含量明顯降低,表明獨一味膠囊通過降低OA關節(jié)局部IL-1β、NO的水平,減輕關節(jié)滑液和滑膜的炎性反應,并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。通過降低關節(jié)液中NO的含量,減少或延緩NO對關節(jié)軟骨基質的破壞作用,減少軟骨細胞的破壞,促進軟骨細胞合成軟骨基質,抑制或減少軟骨細胞凋亡,使關節(jié)軟骨的破壞減少。通過降低關節(jié)液中IL-1β的含量,調節(jié)軟骨細胞的合成代謝,抵抗強大的促炎癥作用,調

11、節(jié)關節(jié)軟骨分解代謝的影響;抑制或延緩骨關節(jié)炎進程。
　　 實驗結果顯示,空白對照組MMP-3、MMP-13的mRNA表達低于模型對照組,而治療組中TIMP-1的mRNA表達高于模型對照組,進一步驗證了OA與基質金屬蛋白酶、金屬蛋白酶抑制劑的調控密切相關。經(jīng)不同劑量獨一味治療后的各組MMP-3、MMP-13的mRNA表達均值均明顯少于模型對照組,提示獨一味能抑制MMP-3、MMP-13在關節(jié)軟骨組織中的表達,并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴