攜帶Rab26 siRNA的自組裝DNA納米載體調控肺微血管內皮滲透性及機制研究.pdf

1、肺微血管內皮細胞組成的內皮屏障，維持著肺間質與血液中的滲透壓平衡，調控著血液中炎癥細胞、蛋白等物質的運輸。各種因素導致的內皮連接破壞、內皮細胞凋亡及壞死破壞了內皮屏障的完整性，影響了內皮屏障功能，導致了血漿蛋白及致炎因子滲出、肺間質及肺泡水腫。故內皮完整性的破壞及內皮滲透性的增高是急性肺損傷重要發(fā)病病理基礎之一，研究其發(fā)生機制，有利于急性肺損傷的干預及治療。
　　革蘭氏陰性桿菌感染是急性肺損傷的重要誘發(fā)因素之一，革蘭氏陰性桿菌的崩

2、解產物脂多糖(LPS)是炎癥反應的重要促發(fā)因子，其可與細胞表面TLR4受體特異性結合，激活TLR4-NF-κB信號通路并由此誘導細胞對其產生應答反應，過度激活的TLR4-NF-κB信號將導致炎癥的發(fā)生和發(fā)展。另外，TLR4不僅能識別LPS等病原體相關分子模式，其對于無菌性損傷后產生的內源性致炎因子即損傷相關分子模式也有應答反應。故TLR4不僅能應答由革蘭氏陰性桿菌感染所引起的炎癥反應，也能應答由非特異損傷導致的無菌性炎癥。由此可見，在急

3、性肺損傷中，TLR4及其下游信號通路的激活及失控可能在炎癥的發(fā)生、發(fā)展及失控中發(fā)揮重要作用。既往研究表明:TLR4可在肺微血管內皮細胞上表達，參與了多種炎癥信號的傳遞過程，將TLR4過表達后將加重肺損傷，而抑制TLR4信號傳遞后可以阻止肺微血管內皮細胞骨架蛋白的重排，抑制細胞間縫隙的形成并由此減輕或阻止肺水腫的發(fā)生。故TLR4可能成為急性肺損傷及急性呼吸窘迫綜合癥治療中一個重要的干預靶點。
　　Rab蛋白是一類小GTP結合蛋白，具

4、有GTP酶活性，故又稱為Rab GTPase，其能調控細胞內囊泡結構的運輸，并由此調控囊泡內蛋白質在細胞中的轉運。不同的Rab蛋白具有不同的功能，我們先前的研究揭示了，Rab1可調控β2-腎上腺素受體及血管緊張素Ⅱ1型受體在大鼠肺動脈平滑肌細胞膜及細胞內的分布，Rab5a可調節(jié)β2-腎上腺素受體在肺微血管內皮細胞中的轉運及胞膜上的表達，也能夠調節(jié)該細胞中VE-cadherin的內吞及F-actin的定位。而Rab26是一種主要調控順向轉

5、運的Rab蛋白，可以調控囊泡從高爾基體到細胞膜的轉運。而TLR4作為膜受體在細胞內合成后需轉運至胞膜才能應答配體傳遞的刺激，那么，Rab26能否調節(jié)肺微血管內皮細胞中TLR4受體的轉運和表達，繼而引起其對LPS等致炎因子應答的改變，并由此調控肺微血管內皮細胞屏障功能？目前尚不清楚。
　　納米材料在醫(yī)學研究及診治中有著巨大的應用前景。早期的研究主要集中在無機納米材料的應用方面，例如常見的有納米金在診斷中的應用及納米銀在抗菌方面的應用

6、等。因納米材料具有多種特有的優(yōu)勢，在生命科學領域，近幾十年來各種先進的納米材料被合成。而通過DNA堿基互補配對自組裝而成的納米材料，因其具有成本低廉、組裝容易、易編程、可修飾等特性，非常便于在醫(yī)學研究以及診斷治療的應用，而其作為載體在遞送siRNA進行研究和基因診斷治療方面有著低毒、低免疫原性、血清穩(wěn)定性佳等獨特優(yōu)勢。在本研究中，我們合成了兩種納米載體ssRNA-TNP及siRab26-DYM，分別探討了這兩種納米載體與單一siRNA相

7、比的應用優(yōu)勢。并使用納米載體研究了Rab26對LPS引起的肺微血管內皮細胞TLR4及NF-κB P65變化所產生影響。然后，我們還檢測了Rab26對肺微血管內皮細胞凋亡及滲透性的影響，進一步明確了Rab26在肺微血管內皮細胞應對炎癥因子刺激時所發(fā)揮的作用。
　　目的:
　　1.合成具有低毒性及良好轉染效果的DNA自組裝納米載體。
　　2.明確Rab26對HPMVECs中TLR4及下游信號通路的調節(jié)作用。
　　3.

8、探討Rab26對HPMVECs細胞凋亡及內皮細胞滲透性的影響。
　　方法:
　　1.構建并驗證DNA自組裝納米載體。
　　(1)構建能夠攜帶mTOR siRNA的DNA三角板納米載體，檢測其產率、轉染效率及細胞攝取率。
　　(2)構建能夠穩(wěn)定轉運Rab26siRNA的DNA三臂Y型模體結構納米載體siRab26-DYM，并檢測其納米載體產率、轉染效率及細胞攝取率。
　　(3)使用RT-PCR及WB檢測siR

9、ab26-DYM對HPMVECs細胞中Rab26基因表達的干擾效果。
　　2.培養(yǎng)人肺微血管內皮細胞，檢測LPS及Rab26對HPMVECs細胞Rab26、TLR4及其下游信號通路的影響。
　　(1)使用Westernblot探測HPMVECs中Rab26及TLR4的表達變化。
　　(2)采用流式細胞術檢測HPMVECs細胞膜TLR4的改變。
　　(3)使用流式細胞術檢測Rab26對HPMVECs細胞膜TLR4受

10、體的調節(jié)作用。
　　(4)使用WB檢測Rab26對HPMVECs細胞總TLR4蛋白及其下游通路分子NF-κBP65的調控。
　　3.檢測LPS及Rab26對HPMVECs細胞凋亡率及其內皮細胞滲透性的影響
　　(1)使用流式細胞術檢測Rab26對HPMVECs細胞凋亡率的影響。
　　(2)使用Transwell小室培養(yǎng)HPMVECs，通過檢測FITC-dextran的透過率以反映HPMVECs內皮細胞通透性。

11、r>　　結果:
　　1.成功組裝了能攜帶mTOR siRNA的DNA自組裝三角板納米載體以及能攜帶Rab26siRNA的Y形模體結構納米載體。凝膠電泳結果分析顯示:通過階梯降溫法納米載體能完成自組裝并達到較高的產率。
　　2.攜帶mTOR siRNA的DNA自組裝三角板納米載體以及攜帶Rab26siRNA的Y型模體納米載體能被細胞高效攝入。通過對攜帶Rab26siRNA的Y型模體納米載體的進一步研究發(fā)現，其能高效沉默目的基因

12、Rab26的表達，且具有濃度及時間依賴性，RT-PCR及Westernblot結果顯示此種納米載體能導致HPMVECs細胞中目的基因Rab26在mRNA及蛋白水平的表達下降。
　　3.LPS處理HPMVECs后Rab26的表達出現了下降，細胞膜TLR4及細胞總TLR4蛋白的表達出現了上升。
　　4.下調HPMVECs細胞中Rab26能提高細胞膜TLR4、細胞總TLR4以及下游NF-κBP65的表達，而上調HPMVECs細胞中

13、的Rab26能降低由LPS引起的TLR4及NF-κB P65的升高。
　　5.LPS處理HPMVECs后，細胞的凋亡率增高，而下調HPMVECs細胞Rab26的表達，能與LPS協同作用提高HPMVECs細胞的凋亡,上調HPMVECs細胞中Rab26能降低LPS刺激后出現的細胞凋亡。
　　6.LPS刺激后，HPMVECs細胞滲透性出現了提高，而下調Rab26能與LPS協同作用進一步提高HPMVECs內皮細胞滲透性，上調Rab2

14、6能一定程度降低由LPS刺激所導致的HPMVECs內皮細胞滲透性的提高。
　　結論:
　　1.成功構建能夠自組裝的攜帶mTOR siRNA的DNA自組裝三角板納米載體及能攜帶Rab26siRNA的DNA納米Y型模體納米載體，其合成方法簡單，產率高，這兩種納米載體能夠高效的轉入細胞。對攜帶Rab26siRNA的DNA納米Y型模體納米載體的進一步研究發(fā)現，其能高效的干擾目標基因的表達。
　　2.LPS可降低HPMVECs中