TGF-β-Smad信號通路相關(guān)細胞因子在小鼠非酒精性脂肪肝干預(yù)中的差異表達.pdf

1、研究目的:
　　探討有氧運動訓練和中藥干預(yù)對高脂膳食誘導下小鼠非酒精性脂肪肝形成的抑制作用，初步揭示有氧運動訓練和中藥對改善小鼠非酒精性肝臟損傷的機制，并探討相關(guān)細胞因子的關(guān)聯(lián)作用。
　　研究方法:
　　實驗對象及分組:KM種雄性小鼠80只，體重18～22g，室溫23℃到25℃自然光照飼養(yǎng)。實驗小鼠購入后，通過高糖高脂膳食灌胃建立小鼠非酒精性脂肪肝模型。每天固定時間進行灌胃，每日1次（下午13時），每周6次。通過5周灌

2、胃構(gòu)建小鼠非酒精性肝損傷模型。建模結(jié)束后隨機選取模型小鼠5只，取新鮮肝組織進行HE染色，檢驗細胞中脂滴著色情況。從造模成功所有小鼠中，淘汰傷病小鼠，保留60只。隨機分成5組，每組12只，各組分別為:陰性對照組(OJ)、陽性對照組(Y)、中藥組(M)、有氧運動組(E)、中藥聯(lián)合有氧運動組(E+M）。實驗方案:有氧運動干預(yù)采用水平動物跑臺方式，前3天為適應(yīng)性跑臺訓練，每次30min，速度8m/min。第4-6天運動時間逐漸遞增至60min，

3、速度12m/min(Pm15:00-17:00)，維持此運動量持續(xù)訓練7周，每周訓練6次，運動訓練時驅(qū)趕停止不動的小鼠已達到額定訓練負荷。中藥干預(yù)的最佳有效劑量通過按人和小鼠的體表面積折算得出等效劑量，并通過口灌胃進行干預(yù)，灌胃前配備成0.5ml灌胃（藥劑濃度為0.2Λg/g）。中藥聯(lián)合運動組劑量:按200ml/kg體重在實驗前配備成所需要濃度進行灌服給藥（總體積0.5ml）。陰性對照組、跑臺組采用相同時間灌服同體積生理鹽水進行干預(yù)，陽

4、性對照組主要使用水飛薊賓懸浮液進行灌服，每次灌胃劑量按人與小鼠體表面積折算0.5ml/次（相當于人體用藥的20倍）。所有需要進行灌胃干預(yù)的小鼠均灌服7周，每周6次。實驗期間記錄小鼠的行為學變化。7周干預(yù)實驗結(jié)束后，小鼠禁食過夜，隨后將肝組織從體內(nèi)剝離進行取材，對各個干預(yù)組的小鼠肝臟組織情況采用顯微結(jié)構(gòu)形態(tài)學觀察，評價各個干預(yù)小組的小鼠肝組織損傷情況;通過免疫組化檢測法來評定小鼠肝組織TGF-β1生長因子的蛋白表達水平情況;RT-PCR法

5、檢測肝組織中smad3、smad4 mRNA表達程度;血生化檢測分析血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、以及總膽固醇(TC)、和超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)在血清中的含量水平。
　　研究結(jié)果:
　?、貶E染色顯示:陰性對照組脂肪病變程度最為明顯，小鼠肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大量纖維化增生，肝細胞發(fā)生變性情況嚴重，有大面積細胞病變壞死出現(xiàn)，細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變形排列混亂;有氧運動組與陰性對照組肝脂肪

6、病變程度進行比較評分有降低;任可見少量肝細胞纖維化，肝細胞變性情況;中藥干預(yù)組和運動干預(yù)組與陰性對照組相比，肝組織細胞任然有較少病變細胞分布出現(xiàn)，肝小葉組織結(jié)構(gòu)有所改變，但肝細胞排列結(jié)構(gòu)欠整齊;陽性干預(yù)組和中藥聯(lián)合運動干預(yù)組較陰性組對比，肝組織無明顯壞死情況，肝小葉組織結(jié)構(gòu)基本正常，肝細胞排列較整齊。
　?、谘鍖W結(jié)果:通過單因素方差分析法，將有氧運動組、中藥組、陽性對照組和有氧運動聯(lián)合中藥組與陰性對照組分別進行兩兩比較，可知在不

7、同的干預(yù)方式下小鼠血清中 ALT、AST和TG、TC、SOD、MDA水平較陰性組都有不同程度降低(P＜0.05)。與陰性組對比有氧運動聯(lián)合中藥組能明顯降低高脂飲食小鼠肝臟中丙二醛(MDA)的含量的趨勢，(p＜0.01)，從而使肝臟MDA含量進一步降低。與陰性組相比有氧運動訓練聯(lián)合中藥組，有顯著提高高脂膳食大鼠肝臟氧化物歧化酶(SOD)的活性作用(p＜0.01)。中藥聯(lián)合有氧運動組與陰性對照組相比ALT、AST和TG、TC檢測指標有明顯下

8、降趨勢(P＜0.05)說明兩者間有協(xié)同作用，ALT，AST、TG、TC的活性表達程度是進一步降低了。
　?、勖庖呓M化檢測顯示:各干預(yù)小組中TGF-β1生長因子蛋白表達水平均低于陰性對照組，其中以中藥聯(lián)合有氧運動組蛋白表達水平差異最大(P＜0.01)。
　?、躌T-PCR結(jié)果顯示:通過檢測，小鼠肝組織中smad3、smad4 mRNA表達水平由高到低排名依次為:陰性對照組、有氧運動組、陽性組、中藥組以及中藥聯(lián)合有氧運動組。其中