產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞(Aldhlal---細(xì)胞)分泌物對(duì)白色脂肪神經(jīng)支配及軸突生長(zhǎng)的調(diào)控作用.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 WT(wild type)小鼠及Aldh1a1-/-型小鼠內(nèi)臟脂肪組織內(nèi)神經(jīng)標(biāo)志物的表達(dá)。
　　目的:檢測(cè)野生型小鼠(C57BL/6J，WT)及Aldh1a1-/-型小鼠iAb(intra abdominalfat，內(nèi)臟脂肪)內(nèi)，促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)細(xì)胞因子的表達(dá)及比較;比較兩種不同細(xì)胞系(WT及Aldh1a1-/-細(xì)胞)間有關(guān)脂肪動(dòng)員，產(chǎn)熱及神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)差異。
　　方

2、法:1.WT小鼠組（n=10，雄性小鼠5只，雌性小鼠5只），Aldh1a1-/-小鼠組(n=10，雄性小鼠5只，雌性小鼠5只)。所有小鼠喂養(yǎng)高脂飼料，持續(xù)喂養(yǎng)180天。處死后，收集小鼠iAb提取蛋白，mRNA及進(jìn)行免疫組化檢測(cè)TH（tyrosine hydroxylase，絡(luò)氨酸羥化酶）及Peripherin。
　　2.培養(yǎng)3T3-L1，WT及Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入神經(jīng)生長(zhǎng)誘導(dǎo)劑(forskolin，

3、10uM)，誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化。兩天后，將細(xì)胞培養(yǎng)液更換成神經(jīng)細(xì)胞分化培養(yǎng)液。在第五天的時(shí)候，電鏡觀察各組細(xì)胞變化。
　　3.孵育WT(n=3)及Aldh1 a1-/-產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞(n=3)，并使用細(xì)胞分化液開始細(xì)胞分化。在分化過程的第五天收集細(xì)胞，提取mRNA。Affymetrix GeneChip基因測(cè)序技術(shù)及nano String技術(shù)對(duì)WT細(xì)胞及Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞進(jìn)行基因測(cè)序及信號(hào)通路分析。
　

4、　結(jié)果:1.Aldh1a1-/-小鼠iAb內(nèi)檢測(cè)出了較高水平的Peripherin及TH。Rbfox3在兩組的表達(dá)水平相近。Nestin及Synopsin在Aldh1a1-/-小鼠iAb內(nèi)表達(dá)量較WT小鼠低。
　　2.WT及3T3-L1細(xì)胞有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能，而Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞則缺少向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能。
　　3.Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞較WT細(xì)胞表達(dá)較高水平的Pparγ，Paparα，Ucp2，

5、EPHA4, EFNA5, Itga3, Plce1, Sema3d, Sema3e, Adamts9。而Gnao1, Gng11,Hhip，Slit2的基因表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論:Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞同WT細(xì)胞在脂肪動(dòng)員，產(chǎn)熱及神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)上有很大的不同，同產(chǎn)熱及神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)的基因在Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞中高表達(dá)。而這些不同則可能同Aldh1a1-/-小鼠能夠?qū)狗逝窒嚓P(guān)。
　　第二部分 LTA

6、(lipolysis and thermogenesis related)促進(jìn)軸突生長(zhǎng)因子對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)的調(diào)控作用的體外及體內(nèi)研究。
　　目的:肥胖小鼠（高脂飼料誘導(dǎo)及基因型肥胖）體內(nèi)LTA促進(jìn)軸突生長(zhǎng)因子表達(dá)較正常體重小鼠是否受損;檢測(cè)LTA促進(jìn)軸突生長(zhǎng)因子在體外及體內(nèi)是否均能夠有效地調(diào)控神經(jīng)生長(zhǎng)。
　　方法:1.設(shè)置三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:A.4月齡的WT小鼠(n=14)，喂養(yǎng)常規(guī)飼料。B.3月齡的肥胖飼料誘導(dǎo)的肥胖WT小鼠購(gòu)自Jac

7、kson Laboratory，繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料3周(n=11)。C:3月齡的基因型肥胖Ob/Ob小鼠購(gòu)自Jackson Laboratory，繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料3周(n=11)。處死小鼠后，取iAb，提取mRNA行NanoString檢測(cè)。比較不同組別間LTA促進(jìn)軸突生長(zhǎng)因子表達(dá)的差別。
　　2.取12-16周齡成年雌性WT小鼠脊神經(jīng)節(jié)(DRG，dorsal root ganglion)，行原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代細(xì)胞培養(yǎng)成功后，設(shè)立5

8、組干預(yù)條件:A:DRG+神經(jīng)培養(yǎng)液組，B:DRG+NT-3(1ng/ml)+神經(jīng)培養(yǎng)液組，C:DRG+NGF(10ng/ml)+神經(jīng)培養(yǎng)液組，D:DRG+ WT細(xì)胞（或E:Aldh1a1-/-細(xì)胞）分化培養(yǎng)后第五天培養(yǎng)液+神經(jīng)培養(yǎng)液(1∶1混合)組。細(xì)胞孵育24小時(shí)后，比較各組間神經(jīng)生長(zhǎng)情況。
　　3.18只3月齡WT雌性小鼠，高脂飼料喂養(yǎng)90天。APLL微膠囊的制作過程如下所述。然后，小鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組（注射1ml PBS

9、進(jìn)iAb，n=5）;空微膠囊組（注射1ml空微膠囊進(jìn)iAb，n=3）;包裹WT細(xì)胞的微膠囊組（含有0.5*106個(gè)WT細(xì)胞的微膠囊1ml PBS注入iAb，n=5）;包裹Aldh1a1-/-產(chǎn)熱細(xì)胞的微膠囊組（含有0.5*106個(gè)Aldh1a1-/-細(xì)胞的微膠囊1ml PBS注入iAb，n=5）。PBS，空微膠囊，包裹細(xì)胞的微膠囊被注射入小鼠iAb后，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)80天。處死后收集含有微膠囊的iAb行蛋白組學(xué)分析及免疫組化檢查。

10、r>　　結(jié)果:1.在肥胖小鼠（高脂飼料誘導(dǎo)或基因型胖肥胖小鼠）體內(nèi)，LTA促進(jìn)軸突生長(zhǎng)因子的表達(dá)較正常體重小鼠受到明顯抑制。
　　2.Aldh1a1-/共培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞（E組），神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)情況遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑NGF及NT3。
　　3.被膠囊包裹的Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞而非WT成熟脂肪細(xì)胞激發(fā)了微膠囊周圍Peripherin的表達(dá)。蛋白Peripherin的表達(dá)量在注射了Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞膠

11、囊的iAb內(nèi)比在注射了空膠囊的iAb內(nèi)有顯著提高。HT也在注射了Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞膠囊的iAb內(nèi)有表達(dá)，而在注射了WT成熟脂肪細(xì)胞的iAb的膠囊附近卻沒有表達(dá)。
　　結(jié)論:LTA促進(jìn)軸突生長(zhǎng)因子在肥胖小鼠體內(nèi)的表達(dá)受損;LTA促進(jìn)軸突生長(zhǎng)因子在體內(nèi)及體外均能有效調(diào)控神經(jīng)生長(zhǎng)。
　　第三部分 RAR(視黃酸受體）對(duì)LTA促進(jìn)軸突生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響及肥胖與受損的LTA的關(guān)系
　　目的:探討ALDH1A1的催化

12、產(chǎn)物RA(RA)對(duì)LTA促進(jìn)軸突生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響及肥胖與受損的LTA促進(jìn)軸突生長(zhǎng)因子的關(guān)系。
　　方法:1.孵育DRG細(xì)胞，分為兩個(gè)組:A.培養(yǎng)液為神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液+Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)液(體積比:1/1)。B.培養(yǎng)液為神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液+Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)液（體積比:1/1）+RA(100nM)。RA在Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞開始分化后即刻，第二天，及第五天加入。第六天，XTI顯微鏡

13、觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)。
　　2.3T3-L1細(xì)胞分化后，加入或不加入Raid(30nM)。NanoString檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平(Sema3d，Sema3e，EFNA5，AdamtS9)。
　　3.3T3-L1細(xì)胞分化培養(yǎng)四天，在第五天加入RA受體的激動(dòng)劑(TTNPB，50nM)或拮抗劑(BMS429，100nM)。NanoString檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平(Sema3d，Sema3e，EFNA5, EPHA4, Adamt

14、S9)。
　　4.5月齡，喂養(yǎng)正常飼料的WT及Aldh1a1-/-小鼠，處死后ELISA檢測(cè)血清中EFNA5含量。分化培養(yǎng)Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞及WT細(xì)胞，比較兩組細(xì)胞培養(yǎng)液中EFNA5的表達(dá)情況。
　　5.將神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的DRG細(xì)胞分為兩組:A.細(xì)胞培養(yǎng)液中不加入EFNA5。B.細(xì)胞培養(yǎng)液中加入EFNA5復(fù)合物(30ng/ml)。共同孵育24小時(shí)后XTI顯微鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
　　6.Brain

15、bow(BB) B6.Cg-Tg(Thy1-Brainbow1.0)HLich/J（n=14），喂養(yǎng)高脂飼料后140天。隨機(jī)分為PBS注射組(n=6，100ul)及EFNA5組(n=8，45ng/ml，100ul)，隔天iAb注射一個(gè)月。一個(gè)月后隨機(jī)處死兩組中各一半小鼠，比較兩組小鼠iAb中TH的表達(dá)情況。另一半小鼠放入代謝籠內(nèi)，冷刺激（4。環(huán)境6小時(shí)）后比較兩組小鼠的代謝率。
　　7.取10例白人女性(5例BMI＜30，5例BM

16、I＞=40)的皮下脂肪組織。RT-PCR檢測(cè)皮下脂肪組織中Aldh1a1、EFNA5及EPHA4的表達(dá)。
　　結(jié)果:1.RA對(duì)LTA促進(jìn)軸突生長(zhǎng)因子的分泌有重要的抑制作用。
　　2.在3T3-L1細(xì)胞中加入Rald后，同LTA分泌相關(guān)的基因:Sema3d，Sema3e，EFNA5，AdamtS9的表達(dá)上調(diào)，較對(duì)照組(未加Rald)有明顯差異。
　　3.EFNA5和EPHA4的表達(dá)受RAR調(diào)控（RAR激動(dòng)劑所抑制;RAR

17、拮抗劑所誘發(fā)）。
　　4.Aldh1a1-/-小鼠較WT小鼠血清中EFNA5含量高。且分化的Aldh1a1-/-產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞較分化的WT細(xì)胞中EFNA5表達(dá)量更高。
　　5.EFNA5在體外可以促進(jìn)DRG神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　6.同PBS組相比，注射了EFNA5組的小鼠iAb中TH的表達(dá)增高。而冷刺激后，注射了EFNA5組小鼠的基礎(chǔ)代謝率較PBS組有明顯升高。
　　7.在肥胖人群中，皮下脂肪中Aldh1a1的表達(dá)