七氟烷預處理對缺氧大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的生存、功能的影響及機制研究.pdf

1、器官缺血可以引起實質(zhì)細胞不可逆性的丟失，是導致殘疾與死亡的一個主要原因。因此，有許多方法被研究用來治療此類疾病，而近年來，骨髓間充質(zhì)干細胞治療獲得了極好的療效，引起越來越多的人關(guān)注與研究。
　　 隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞治療尚存在著諸多問題。其中較為嚴峻的是，移植后的干細胞的生存及功能都面臨著極大威脅。文獻報道心肌缺血干細胞移植治療中，移植后進入體內(nèi)的干細胞在第一個24小時內(nèi)存活率低于1％，同時發(fā)現(xiàn)，直接注入到心肌梗

2、死區(qū)的標記BMSCs僅散在分布于分化良好、結(jié)構(gòu)完整的大血管壁內(nèi)和成熟心肌之間而不在或偶在肉芽組織替代的梗死區(qū)（此區(qū)域內(nèi)血管稀少，血液供應(yīng)最差）和其毛細血管周圍（原缺血區(qū)，血液供應(yīng)較差）出現(xiàn)，而細胞之間并不出現(xiàn)培養(yǎng)條件下以種子細胞為中心的擴展性增殖，在梗死區(qū)域BMSCs并不充分出現(xiàn)心肌細胞表型，這些結(jié)果均提示區(qū)域性缺氧環(huán)境不利于BMSCs生存，同時影響其增殖和遷移等功能。由此，如何增加惡劣環(huán)境下大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的生存及功能成為干細胞移

3、植的一項亟待解決的問題及研究的熱點。
　　 體外缺氧預處理借鑒于經(jīng)典缺血預處理的理念，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其能夠有效地降低骨髓間充質(zhì)干細胞缺氧/血清剝奪，糖氧剝奪，氧化應(yīng)激等復制體內(nèi)缺氧環(huán)境惡性刺激引起的損傷，而一些藥物實施的藥理學預處理也被證明能復制缺氧預處理保護骨髓間充質(zhì)干細胞的作用。
　　 七氟烷是目前臨床上一種廣泛應(yīng)用的吸入性麻醉藥。近年來，研究不斷證實，七氟烷預處理或后處理對多種組織細胞缺血再灌注均有保護作用，如心肌，腦及

4、脊髓神經(jīng)細胞，血管內(nèi)皮細胞等。最近，有報道稱，低濃度的七氟烷短暫預處理人干細胞樣內(nèi)皮祖細胞在體外實驗中能促進其集落形成，提高其增殖能力，并有另一篇報道稱，七氟烷預處理促進了帶有內(nèi)皮祖細胞標記CD34+， flk-1+的細胞向外周血移動。但未見文獻報道七氟烷預處理對缺血微環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細胞影響的相關(guān)研究。
　　 因此，本實驗擬通過體外復制干細胞移植后缺血組織的缺血缺氧微環(huán)境，旨在探討七氟烷預處理對嚴重缺氧環(huán)境下大鼠骨髓間充質(zhì)干

5、細胞生存、遷移、分泌功能的影響及預處理后的間充質(zhì)干細胞降低神經(jīng)樣細胞PC12細胞缺血損傷的作用，Western Blot分析HIF-1α，Akt及p-Akt的表達探討預處理的可能機制。
　　 實驗方法：
　　 一、七氟烷預處理對缺氧大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞生存、遷移、分泌功能的影響
　　 采取全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，流式細胞術(shù)分析表面標記CD29、CD45、CD44、CD34，進行成骨、成脂分化鑒定

6、。采用厭氧發(fā)生器建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外缺氧并行血清剝奪以模擬體內(nèi)缺血環(huán)境建立細胞體外缺氧模型，應(yīng)用吸入性麻醉藥七氟烷進行預處理，摸索預處理條件。選取生長狀態(tài)良好的P3細胞隨機分為3組:正常對照組(N)、缺氧血清剝奪組(H/SD)、2％七氟烷預處理2小時組(SPC)，對各組細胞行胰酶消化制成單細胞懸液，Annexin-Ⅴ/PI染色后流式細胞儀檢測凋亡率;利用Transwell實驗檢測各組細胞遷移能力的變化;收集各組細胞進行Weste

7、rn Blot分析VEGF的表達，收集上清液進行ELISA分析VEGF的濃度。
　　 二、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞對缺氧PC12的生存率的影響
　　 通過對神經(jīng)樣細胞PC12行低氧血清剝奪處理建立神經(jīng)元缺血損傷的體外模型，采用Transwell小室共培養(yǎng)方法建立BMSCs與PC12細胞的共培養(yǎng)體系。選取生長良好的PC12細胞隨機分為四組:正常對照組、H/SD組，BMSCs共培養(yǎng)+H/SD組、SP-BMSCs共培養(yǎng)+H/SD組

8、，對各組細胞行胰酶消化制成單細胞懸液，Annexin-Ⅴ-FITC標記后流式細胞術(shù)檢測PC12細胞的凋亡情況。
　　 三、七氟烷預處理對缺氧大鼠骨髓間充質(zhì)千細胞HIF-1α、Akt及p-Akt的表達的影響
　　 選取生長狀態(tài)良好的P3細胞隨機分為3組:正常對照組(N)、缺氧血清剝奪組(H/SD)、2％七氟烷預處理2小時組(SPC)，Western Blot分析嚴重缺氧環(huán)境下大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞及七氟烷預處理中HIF-1α

9、、Akt及p-Akt的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1、分離培養(yǎng)的BMSCs細胞呈成纖維狀貼壁生長，第3代細胞經(jīng)流式細胞檢測CD29為90.5％、CD90為94.7％、CD34為1.9％、CD45為3.6％，細胞能向脂肪、骨細胞分化。
　　 與正常組比較，24小時缺氧與血清剝奪夠顯著增加大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞Annexin-Ⅴ陽性細胞比率(21.39±3.17％，vs正常培養(yǎng)組4.33±1.23％，P＜0.05);與

10、缺氧組比較，七氟烷預處理能降低Annexin-Ⅴ陽性細胞比率(11.00±1.50％，vsH/SD組， P＜0.05);
　　 缺氧組，大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)遷移數(shù)量顯著降低(vs正常培養(yǎng)組，P＜0.05);2％七氟烷預處理能部分逆轉(zhuǎn)缺氧引起的遷移數(shù)量減少(vs H/SD組，P＜0.05);
　　 與正常培養(yǎng)的BMSCs對照組比較，H/SD組VEGF表達量較正常對照組增加，而與H/SD組比較，七氟烷預處理組表

11、達量及上清VEGF濃度增加。
　　 2、正常培養(yǎng)的PC12細胞凋亡率低(9.89±0.44％); H/SD組，PC12細胞凋亡明顯增加(82.85±3.34％，vs正常培養(yǎng)組，P＜0.05);與BMSCs共培養(yǎng)后PC12細胞凋亡率降低(59.87±2.88％，vs H/SD組，P＜0.05);而與SP-BMSCs共培養(yǎng)后其凋亡率進一步降低(44.84±2.16％，vs H/SD組和BMSCs組，P＜0.05)。
　　 3

12、、Western Bloting檢測結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)的BMSCs對照組比較，H/SD組HIF-1α增加，而與H/SD組比較，七氟烷預處理組表達量進一步增加;H/SD組p-Akt/Akt表達比例較正常對照組降低，七氟烷預處理組p-Akt/Aktb表達比例增加。
　　 結(jié)論：
　　 1.全骨髓貼壁法可以成功分離并獲得大量純度較高的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞;長時間嚴重缺氧與血清剝奪能誘發(fā)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞出現(xiàn)明顯凋亡，2％七

13、氟烷預處理2小時能顯著降低缺氧血清剝奪引起的凋亡;嚴重缺氧環(huán)境下大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞遷移能力顯著降低，七氟烷預處理能提高嚴重缺氧環(huán)境下的遷移能力;七氟烷預處理能顯著增加嚴重缺氧環(huán)境下BMSCs的VEGF表達及分泌;
　　 2.七氟烷預處理后的較之未經(jīng)預處理的骨髓間充質(zhì)干細胞能夠有效的降低缺血引起的神經(jīng)細胞凋亡;
　　 3.七氟烷預處理能逆轉(zhuǎn)缺氧誘導的引起的p-Akt/Akt表達比例降低，在低氧基礎(chǔ)上進一步增加HIF-1α