大鼠氣管干細(xì)胞增殖分化過(guò)程中Notch信號(hào)分子的表達(dá)及意義.pdf

1、本研究利用5-FU介導(dǎo)的大鼠氣管上皮損傷修復(fù)模型，檢測(cè)了大鼠氣管干細(xì)胞增殖分化過(guò)程中Notch信號(hào)分子的表達(dá)及意義。 材料和方法： 1、離體大鼠氣管損傷修復(fù)模型的制備及DAPT和Jag-1處理 取約200克左右的Wistar大鼠，雌雄不限，水合氯醛麻醉，無(wú)菌條件下取出氣管，PBS沖洗，置于DMEM/F12培養(yǎng)液中(含10％胎牛血清)。取正常氣管，剪取一氣管環(huán)固定，留做石蠟切片，灌入蛋白酶XIV(0.5mg/ml)

2、，結(jié)扎另一端，4℃消化過(guò)夜，收集消化液，加FCS至終濃度為2.5％終止酶反應(yīng)收集正，常氣管上皮細(xì)胞于2mlEppendorf管中，-70℃凍存，留做mRNA。其余氣管組織分為DAPT預(yù)處理組、Jag-1預(yù)處理組、對(duì)照組、DAPT處理組和Jag-1處理組。DAPT及Jag-1預(yù)處理組先在培養(yǎng)液中加入5μM DAPT或40μM Jag-1，37℃，5％CO2孵育12小時(shí)，棄去上述培養(yǎng)液，于DMEM/F12(含10％胎牛血清)培養(yǎng)液中加入終濃

3、度為120mg/ml的5-FU，37℃，5％CO2孵育12小時(shí)，棄去上述培養(yǎng)液，換成新鮮DMEM/F12液(含10％胎牛血清)；對(duì)照組單純5-FU作用；DAPT處理組和Jag-1處理組在5-FU作用后換為含有5μM DAPT或40μM Jag-1的DMEM/F12(含10％胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)，方法同上，分別于換液后0、3、6、12、24、48小時(shí)取出氣管組織分別固定，留做石蠟切片；消化，收集細(xì)胞于2mlEppendorf管中，-70℃保

4、存，以備RNA和蛋白提取。 2、RT-PCR檢測(cè) 按TrizolTM試劑使用說(shuō)明提取氣管上皮細(xì)胞總RNA，檢測(cè)它的濃度，純度和完整性。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明操作，選用Oligo-dT做引物合成第一鏈cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為：30℃ 10min，40℃ 40min，99℃ 5min，5℃ 5min；PCR反應(yīng)條件為：94℃變性2min后，94℃ 30s，退火，72℃ 1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)

5、物使用2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色分析表達(dá)結(jié)果，測(cè)灰度值，統(tǒng)計(jì)。相同條件下用β-actin作為內(nèi)對(duì)照。 3、蛋白印跡檢測(cè) 按蛋白抽提試劑盒說(shuō)明抽提氣管上皮細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳，50V恒壓濕轉(zhuǎn)120mins，BSA室溫封閉2hrs，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗37℃孵育2hrs，DAB顯色。轉(zhuǎn)膜后各步之間均用洗膜液洗膜3次，每次5mins。相同條件下用β-actin作為內(nèi)對(duì)照。 4、間接免疫熒光檢測(cè)氣管上

6、皮ABCG2，CK19，Notch3和Jagged1的表達(dá) 連續(xù)切片，石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，非免疫動(dòng)物血清封閉，一抗分別為Goat anti-ABCG2,Rabbit anti-CK19，Rabbit anti-Notch3和Goat anti-Jagged1；二抗分別TRITC標(biāo)記Rabbit anti Goat IgG和FITC標(biāo)記Goat anti Rabbit IgG。DAPI復(fù)染細(xì)胞核。50％緩沖甘油封片，熒光顯

7、微鏡OlympasBX51下觀察并照相。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：用等量的0.01mol/L PBS代替一抗，其余步驟同前。 5、統(tǒng)計(jì)分析 所有的RT-PCR實(shí)驗(yàn)和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次，所得數(shù)據(jù)的值用均數(shù)(means)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)來(lái)表示。用SPSS 11.5軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、5-FU誘導(dǎo)損傷修復(fù)過(guò)程中ABCG2、CK19和PCNA的表達(dá)變化

8、 正常氣管上皮幾乎沒(méi)有ABCG2表達(dá)，去除5-FU作用后0h，ABCG2少量表達(dá)，隨后表達(dá)量逐漸增高，至6h達(dá)到峰值，隨后逐漸降低，至48h幾乎恢復(fù)正常水平；正常氣管上皮CK19高表達(dá)，去除5-FU作用后0h，CK19表達(dá)極微量，之后表達(dá)逐漸增加，至12h后CK19表達(dá)量迅速上升，至48h幾乎恢復(fù)正常水平；正常氣管上皮PCNA微量表達(dá)，去除5-FU作用后0h表達(dá)量仍然很低。3h后PCNA開(kāi)始表達(dá)并逐漸增高，至6h達(dá)到峰值，隨后下降，

9、至48h時(shí)，基本恢復(fù)正常水平。 2、Notch信號(hào)分子在大鼠氣管上皮的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，正常大鼠氣管上皮中Notch-1、Notch-3、Jagged-1、Hes1、Hey1和Hey2均有表達(dá)；Notch-2、Jagged-2、Hes3和Hes5在正常氣管上皮及去除5-FU作用后氣管干細(xì)胞增殖分化過(guò)程中均沒(méi)有明顯表達(dá)。Notch-3、Jagged-1和Hey1在5-FU打擊修復(fù)過(guò)程中表達(dá)量有顯著差異。

10、3、5-FU誘導(dǎo)損傷修復(fù)過(guò)程中N3ICD，Jagged1及Hey1的表達(dá)變化 蛋白印跡檢測(cè)大鼠氣管上皮損傷修復(fù)過(guò)程中N3ICD，Jagged1及Hey1的蛋白水平發(fā)現(xiàn)，正常氣管上皮N3ICD、Jagged-1和Hey1僅有微量表達(dá)。5-FU打擊后Oh，其表達(dá)增高，并隨著氣管上皮的修復(fù)逐漸增加，分別在6h、6h和12h達(dá)到高峰，隨后逐漸降低，至48-72h降至正常水平。 4、間接免疫熒光檢測(cè)5-FU作用后大鼠氣管上皮和Ja

11、gged1、Notch3、ABCG2和CK19的表達(dá) Jagged1為膜表達(dá)，多表達(dá)于上皮基底側(cè)。打擊后Oh，氣管上皮可見(jiàn)少量Jagged1陽(yáng)性細(xì)胞，隨氣管上皮的修復(fù)逐漸增多，至6h Jagged1陽(yáng)性細(xì)胞最多，隨后Jagged1蛋白表達(dá)逐漸減少，至48h，接近恢復(fù)正常水平。正常氣管上皮Notch3絕大部分為膜陽(yáng)性，5-FU打擊后Oh，Notch3核陽(yáng)性細(xì)胞增多，至6h達(dá)到高峰，隨后降低，至48h僅見(jiàn)極少的核陽(yáng)性細(xì)胞。大部分Ja

12、gged-1陽(yáng)性細(xì)胞與Notch3核陽(yáng)性細(xì)胞相鄰，并分布與氣管上皮的相似區(qū)域。ABCG2和CK19均為膜表達(dá)，表達(dá)于氣管上皮不同的細(xì)胞，變化規(guī)律與Western blot結(jié)果一致，絕大部分ABCG2陽(yáng)性細(xì)胞為Notch3核陽(yáng)性細(xì)胞。 5、DAPT阻斷和Jag-1持續(xù)激活Notch信號(hào)通路對(duì)大鼠氣管上皮損傷修復(fù)的影響 免疫印跡結(jié)果顯示，DAPT處理后6小時(shí)Notch通路活性明顯低于對(duì)照組，24h時(shí)Notch通路幾乎完全失活

13、。DAPT阻斷后，ABCG2增高幅度下降，并于6h后顯著低于對(duì)照組；K19表達(dá)持續(xù)增高，并于6h后顯著高于對(duì)照組，至24h時(shí)基本達(dá)到正常水平，并持續(xù)高表達(dá)；PCNA增高幅度下降，6h后顯著低于對(duì)照組，至24h時(shí)已幾乎檢測(cè)不多PCNA的表達(dá)。Jag-1持續(xù)激活Notch通路，ABCG2增高幅度升高，并于6h后顯著高于對(duì)照組；CK19表達(dá)降低，并于6h后顯著低于對(duì)照組；PCNA增高幅度上升， 6h后顯著高于對(duì)照組。 HE染色顯示，

14、5-FU誘導(dǎo)損傷后，用DAPT阻斷Notch通路，與單純5-FU作用的對(duì)照組相比，氣管上皮的形態(tài)于6h開(kāi)始出現(xiàn)差異。此時(shí)，大部分氣管上皮細(xì) 胞已呈立方狀；12h，可見(jiàn)纖毛出現(xiàn)在氣管上皮；12h-48h細(xì)胞沒(méi)有明顯增加，氣管上皮呈單層立法上皮，被覆纖毛。用Jag-1持續(xù)激活Ntoch通路的情況下，細(xì)胞增加迅速，但始終未見(jiàn)纖毛出現(xiàn)，48h后，氣管上皮沒(méi)有恢復(fù)假覆層纖毛柱狀上皮的結(jié)構(gòu)。 6、DAPT及Jag-1預(yù)處理對(duì)大鼠氣管

15、上皮損傷修復(fù)的影響 正常氣管上皮經(jīng)DAPT預(yù)處理后，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。再經(jīng)5-FU作用后，氣管上皮細(xì)胞幾乎全部脫落，沒(méi)有細(xì)胞殘留。經(jīng)48h后，氣管上皮仍沒(méi)有修復(fù)的跡象。正常大鼠氣管上皮經(jīng)Jag-1預(yù)處理后，纖毛細(xì)胞明顯減少。再經(jīng)5-FU作用后，氣管基底膜上殘留細(xì)胞數(shù)量增加，并于24h時(shí)基本恢復(fù)了假覆層纖毛柱狀上皮的結(jié)構(gòu)。 免疫熒光顯示，正常氣管上皮ABCG2(+)細(xì)胞數(shù)量稀少；經(jīng)DAPT預(yù)處理后，氣管上皮未見(jiàn)ABCG2陽(yáng)

16、性細(xì)胞。經(jīng)Jag-1預(yù)處理后，氣管上皮ABCG2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加。 結(jié)論： 1、5-FU作用后48h，氣管上皮形態(tài)及增殖分化狀態(tài)基本恢復(fù)正常水平； 2、Notch-1、Notch-3、Jagged-1、Hes21、Hey1和Hey2可能參與了正常大鼠氣管上皮穩(wěn)態(tài)的維持； 3、Notch-3、Jagged-1和Hey1可能在氣管干細(xì)胞增殖分化的過(guò)程中發(fā)揮了作用； 4、Notch信號(hào)對(duì)氣管干細(xì)胞未分化