大鼠氣管干細胞增殖分化過程中ABCG2的表達及Wnt信號機制的研究.pdf

1、干細胞是指具有無限或較長期的自我更新能力，并能產(chǎn)生至少一種高度分化子代細胞的細胞。按照組織發(fā)生學(xué)來源，可將干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞。近年來對成體干細胞的研究越來越受到重視，目前已發(fā)現(xiàn)的成體干細胞有造血干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞、肌干細胞、角膜干細胞、胰腺干細胞、皮膚干細胞、肝臟干細胞等，并已不同程度地用于臨床治療。但迄今為止國際上對氣管干細胞的研究還很不完善。先前本研究組已成功地在體內(nèi)外建立了氟脲嘧啶介導(dǎo)的大鼠氣管損傷

2、修復(fù)模型，并對氣管干細胞進行了初步的定位和性狀解析。 干細胞具有排出熒光染料Hoechst33342的特性。近年來的研究表明，干細胞的這一特性(即SP表型)與ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員之一的ABCG2(又名乳癌耐藥蛋白1，Bcrp1)的表達有關(guān)?，F(xiàn)已證明在多個物種的多種組織來源的SP細胞中檢測到ABCG2的高表達，如骨髓、肝、肌組織、乳腺上皮及ES細胞。ABCG2與SP表型的密切關(guān)系，使得ABCG2成為多潛能干細胞

3、的共同標(biāo)志，對干細胞的鑒定具有重要意義。為更深入地了解氣管干細胞的特性，本研究在5-FU介導(dǎo)的氣管上皮損傷修復(fù)模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用間接免疫熒光法和Weternblot動態(tài)觀測了修復(fù)過程中各時間點氣管上皮ABCG2蛋白的表達，借以原位觀察了氣管干細胞在整個修復(fù)過程中的動態(tài)分布。 近年來的研究表明Wnt信號及其成員對胚胎及成體的原始細胞的增殖和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。為探討氣管干細胞的增殖分化與Wnt/β-catenin信號途徑的關(guān)系

4、，闡明干細胞增殖分化的分子機制，本研究應(yīng)用RT-PCR及間接免疫熒光的方法動態(tài)觀測了修復(fù)過程中Wnt信號相關(guān)成分Wnt1、β-catenin、cyclinD1mRNA的變化以及β-catenin蛋白的細胞內(nèi)分布，初步探討了Wnt/β-catenin信號途徑參與調(diào)控氣管干細胞增殖分化過程的可能機制。 材料和方法： 1.離體氣管損傷模型的制備：200g左右的Wistar大鼠，雌雄不限，中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(經(jīng)中國醫(yī)科

5、大學(xué)實驗動物倫理委員會同意)，腹腔注射10％水合氯醛麻醉，無菌條件下取出氣管，置于DMEM/F12培養(yǎng)液中(含10％胎牛血清)，剪成約2-3mm的氣管環(huán)，于倒置顯微鏡下觀察纖毛擺動良好，取一組織塊作正常對照；于培養(yǎng)液中加入終濃度為120mg/ml的5-FU，37℃，5％CO2孵育12小時，棄去上述培養(yǎng)液，換成新鮮DMEM/F12(含10％胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)，于換液后0、3、6、9、12、24、48小時分別取出一組織塊，10％中性福爾馬林

6、固定，石蠟包埋，制成4μm厚的組織切片。另取換液后各時間點的氣管組織及正常氣管組織，解剖顯微鏡下機械剝離上皮，放于1.5mlEppendorf管中，-70℃保存，以備總蛋白和總RNA的提取。 2.將石蠟切片做HE染色，光鏡觀察并照相。 3.間接免疫熒光法檢測氣管上皮ABCG2表達：石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，非免疫動物血清封閉，一抗用ABCG2，二抗為TRITC標(biāo)記兔抗山羊IgG，用DAPI復(fù)染細胞核。50％緩沖甘油封片

7、，熒光顯微鏡Olympas-BX51下觀察并照相。陰性對照實驗：用等量的0.01mol/LPBS代替一抗，其余步驟同前。 4.氣管上皮ABCG2蛋白的半定量檢測：取5-FU作用前后的氣管上皮組織，提取總蛋白質(zhì)。用Westernblot分析ABCG2蛋白的表達情況。 5.應(yīng)用RT-PCR法檢測Wnt信號相關(guān)成分Wnt1，β-catenin，cyclinD1mRNA的表達：按TrizolTM試劑使用說明提取剝離的氣管上皮總R

8、NA，引物序列如下：Wnt1sense5’-AGGTGAAAGGGCAAGGAA-3’，antisense5’-CTGGCAGACAAGAGGAGTGA-3’(304bp)；β-cateninsense5’-GCGCTCCCCTCAGATGGTGTC-3’，antisense5’-ACGATGGCCGGCTTGTTGC-3’(500bp)；cyclinD1sense5’-TGGCGTTTGGAAGTAGGG-3’，antisense5’

9、-GAGCGGCGGCAAGAATGT-3’(420bp)；β-actinsense5’-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3’，antisense5’-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3’(587bp)。擴增產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，Bio-Rad凝膠圖像成像儀觀察并記錄結(jié)果，測灰度值。 6.制備氣管上皮細胞涂片：取正常及5-FU作用后的氣管組織，于換液后0、3、6、12、2

10、4、48小時分別取出氣管組織，蛋白酶XⅣ消化，涂于載玻片上，固定。-20℃保存。 7.氣管上皮細胞涂片β-catenin間接免疫熒光檢測：將氣管上皮細胞涂片用正常山羊血清封閉，一抗用兔抗β-catenin，二抗為山羊抗兔TRITC標(biāo)記的IgG，DAPI復(fù)染細胞核，50％緩沖甘油封片，在熒光顯微鏡OlympasBX51下觀察并照相。對照實驗：用等量的0.01mol/LPBS代替一抗。 結(jié)果： 1.5-FU作用12h

11、后，氣管上皮全部脫落，殘留間隔分布的裸核樣細胞(即G0期細胞)，其中部分細胞管腔側(cè)胞膜呈現(xiàn)強紅色熒光信號，即為ABCG2的膜陽性表達；去除5-FU后3小時，細胞數(shù)目逐漸增多，大部分為扁平狀，ABCG2陽性細胞數(shù)隨之增多；恢復(fù)6小時，上皮細胞數(shù)目繼續(xù)增多，同時ABCG2陽性細胞數(shù)繼續(xù)增多，強紅色熒光信號在管腔表面形成不連續(xù)的線狀；至恢復(fù)24小時，上皮細胞呈立方狀，并連接成片，ABCG2陽性信號較前明顯減少，散在分布于少數(shù)細胞管腔側(cè)膜上；恢

12、復(fù)48小時，氣管上皮接近恢復(fù)假復(fù)層結(jié)構(gòu)，此時僅見極少量ABCG2陽性細胞。正常氣管上皮未檢測到ABCG2的強紅色熒光信號表達。對照實驗結(jié)果呈陰性。 2.Westernblot結(jié)果顯示ABCG2蛋白在氣管損傷修復(fù)過程中各時相的表達有明顯差異。去除5-FU后恢復(fù)0小時僅有極少量表達，而后其水平呈增加趨勢，至6小時達到高峰，恢復(fù)12、24小時ABCG2表達量依次減弱，至48小時只有輕度表達；正常氣管上皮表達陰性。 3.RT-P

13、CR結(jié)果顯示在正常大鼠氣管上皮無Wnt1mRNA的表達，β-cateninmRNA輕度表達，cyclinD1mRNA無表達。在經(jīng)5-FU作用后恢復(fù)0小時，此時即可檢測到Wnt1mRNA的表達，β-cateninmRNA一時性輕度下降。去除5-FU后3小時觀測到扁平的上皮細胞，此時Wnt1mRNA水平增加并達到高峰，β-cateninmRNA在6小時達到高峰，cyclinD1mRNA在12小時達到高峰。24小時上皮細胞數(shù)目增多，呈立方狀，

14、并連接成片，可見纖毛及粘液顆粒，此時三者表達水平均下調(diào)，48小時接近恢復(fù)假復(fù)層纖毛柱狀上皮，此時Wnt1及cyclinD1mRNA無表達，β-cateninmRNA少量表達。 4.重建過程中β-catenin的核移位：對取自不同時間點的氣管上皮細胞的間接免疫熒光染色結(jié)果顯示，在正常的氣管上皮細胞，β-catenin定位于細胞膜；在去除5-FU后6小時及12小時，β-catenin出現(xiàn)明顯的胞漿內(nèi)蓄積及核移位；至48小時修復(fù)基本完

15、成時又恢復(fù)為膜表達。 結(jié)論： 1.在5-FU介導(dǎo)的氣管上皮損傷修復(fù)模型的基礎(chǔ)上動態(tài)觀測了修復(fù)過程中各時間點氣管上皮ABCG2蛋白的表達，結(jié)果表明ABCG2的表達與干細胞的數(shù)量呈正相關(guān)，可作為氣管干細胞的標(biāo)志物，為氣管干細胞的分選提供了條件。 2.Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑參與調(diào)控氣管干細胞增殖分化全過程。修復(fù)早期促進氣管干細胞的增殖，修復(fù)后期促進祖細胞向特定的細胞分化。該研究有助于理解干細胞自我更新和