多功能轉錄因子CTCF與Vigilin片段體外相互作用的初步研究.pdf

1、背景和目的：人類基因組計劃完成以后，生命科學的研究進入了后基因組時代。蛋白質介導細胞的許多生物學活性，而且大部分蛋白質都是和其他蛋白質形成復合物來發(fā)揮作用。為了更好理解細胞的生命活動，必須很好了解蛋白質單體和復合物的功能，這就涉及到蛋白質相互作用的研究。蛋白質相互作用作為蛋白質組學的重要組成部分，已經(jīng)成為了生物技術的一個重要領域。CTCF是廣泛存在于真核生物的多功能轉錄調(diào)節(jié)因子，其基因定位于16q22.1，人CTCF蛋白質全長727個氨

2、基酸殘基，中段312個氨基酸殘基形成11個連續(xù)鋅指結構。CTCF通過11鋅指結構形成不同的組合選擇性識別多種DNA序列，通過與DNA靶位點結合發(fā)揮對多個基因的表達調(diào)控作用，具有啟動子抑制和激活、基因沉默、增強子阻斷、調(diào)控基因印跡、X染色體失活等多方面的功能。CTCF通過它的靶基因調(diào)控細胞生理的方方面面，在細胞生長、增殖、分化、凋亡、遺傳、表遺傳和腫瘤發(fā)生發(fā)展等各方面起著基礎性的調(diào)節(jié)作用。 本室前期研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)以pGBK

3、T7-CTCF為誘餌篩選人肝cDNA酵母文庫，獲得了與CTCF相互作用的人。vigilin同源酵母陽性克隆及其蛋白質編碼基因。本研究采用表達GST融合蛋白質的方案，克隆、原核表達CTCF全長蛋白和N、Zn、C三個片段；用表達His融合蛋白質的方案，克隆、原核表達Vigilin-315和Vigilin-3KH片斷；親和層析純化融合蛋白；用GST沉降技術檢測CTCF及其片段和Vigilin片段間是否存在相互作用。 方法：編碼CTCF

4、全長序列的pGEM7Zf(-)-CTCF質粒由美國紐約州立大學W．W．Quitschke教授惠贈，以其為模板，分別構建GST融合表達重組質粒pGEX-4T-2-CTCF，pGEX-4T-2-CTCF-N，pGEX-4T-2-CTCF-Zn，pGEX-4T-2-CTCF-C，轉化宿主大腸桿菌BL21并做雙酶切和測序鑒定；優(yōu)化IPTG誘導表達條件，誘導表達GST融合蛋白并經(jīng)GSTrap FF親和層析柱純化得到GST融合蛋白CTCF，CTCF

5、-N，CTCF-Zn，CTCF-C。將與vigilincDNA同源的315號克隆和經(jīng)PCR擴增所得Vigilin 1-3KH序列插到原核表達載體pET28-a(+)，分別構建His融合表達重組質粒pET28a(+)-315，pET28a(+)-3KH，分別轉化宿主大腸桿菌BL21(DE3)，雙酶切和測序鑒定，優(yōu)化IPTG誘導表達條件；表達His融合蛋白并經(jīng)HisTrap親和層析柱純化得到His融合蛋白Vigilin-315并進行Far-

6、Western Blot鑒定。用CTCF及其片段GST融合表達的蛋白質為誘餌，利用GST沉降技術檢測His融合表達的Vigilin-315片段是否與其存在相互作用。 結果：重組質粒pGEX-4T-2-CTCF，pGEX-4T-2-CTCF-N，pGEX-4T-2-CTCF-Zn ，pGEX-4T-2-CTCF-C ，pET28a(+)-315 ，pET28a(+)-3KH，經(jīng)雙酶切和測序鑒定證實構建成功。GST融合蛋白CTCF，

7、CTCF-N，CTCF-Zn，CTCF-C均在大腸桿菌中成功誘導表達，融合蛋白經(jīng)親和層析純化獲得純化蛋白；His融合蛋白Vigilin-315，Vigilin-3KH在大腸桿菌中成功誘導表達，融合蛋白Vigilin-315經(jīng)親和層析純化、包涵體復性，獲得純化蛋白。GST沉降實驗檢測GST融合CTCF蛋白及其片段與His融合Vigilin315蛋白之間相互作用，結果顯示GST融合的CTCF以及其三個片段均未與His融合Vigilin-31

8、5蛋白發(fā)生體外相互作用。 結論：成功構建了原核表達GST融合蛋白質粒pGEX-4T-2-CTCF，pGEX-4T-2-CTCF-N，pGEX-4T-2-CTCF-Zn，pGEX-4T-2-CTCF-C：及His融合蛋白表達質粒pET28a(+)-315，pET28a(+)-3KH。對融合蛋白表達條件進行了優(yōu)化，獲得了高效表達的GST融合蛋白CTCF，CTCF-N，CTCF-Zn，CTCF-C；及His融合蛋白Vigilin-31