番鴨白細(xì)胞介素-2基因的克隆與原核表達(dá).pdf

1、白細(xì)胞介素-2(IL-2)主要是由T淋巴細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞系分泌產(chǎn)生的一類最有力的T細(xì)胞生長因子，屬于Th1型細(xì)胞因子。IL-2是一種糖蛋白，具有廣泛生物活性，能夠有效地提高免疫功能，具有誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和分化，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-2受體(IL-2R)的表達(dá)；促進(jìn)B細(xì)胞分化、增殖及分泌抗體，同時(shí)活化B細(xì)胞表達(dá)高親和力IL-2R；可誘導(dǎo)和增強(qiáng)NK細(xì)胞、單核細(xì)胞等的殺傷活性，也可促進(jìn)其他細(xì)胞因子的分泌以及刺激T細(xì)胞在體外的生長；增強(qiáng)淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)

2、胞表面黏附因子的表達(dá)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞及其它活化細(xì)胞的粘附及移動(dòng)能力；增加抗原遞呈細(xì)胞表面MHCⅠ和Ⅱ類分子的數(shù)量，增強(qiáng)抗原遞呈作用。在免疫應(yīng)答系統(tǒng)中起著極其重要的調(diào)節(jié)作用，是一種天然的免疫增強(qiáng)佐劑。
　　 參照gene bank已發(fā)表的綠頭鴨IL-2基因序列，自行設(shè)計(jì)并合成一對特異性引物，以經(jīng)有絲分裂原ConA活化的30日齡雛番鴨脾淋巴細(xì)胞總RNA為模板，應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增出片段大小為423bp的目的片段，將擴(kuò)增片段通過T-

3、A策略連接到克隆質(zhì)粒pMD18-T載體上，經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定以及DNA序列測定，證明克隆片段為番鴨IL-2基因。該基因涵蓋番鴨IL-2基因的全部開放閱讀框(ORF)，編碼140個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。與gene bank中報(bào)道的番鴨IL-2基因序列有100％的同源性，與綠頭鴨IL-2基因序列進(jìn)行比較，在ORF內(nèi)有7個(gè)堿基不同，但其推導(dǎo)編碼的氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)完全相同。通過二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，它們含有類似于哺乳動(dòng)物的α螺旋。IL-2基因序列分

4、析表明，番鴨IL-2基因與其它品種禽類IL-2基因有較高的同源性，從而進(jìn)一步證明了番鴨IL-2基因具有較強(qiáng)的保守性。
　　 應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將番鴨IL-2基因亞克隆到GST融合基因表達(dá)載體pGEX6P-1的相應(yīng)位點(diǎn)中，將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。通過IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌中表達(dá)了重組番鴨IL-2蛋白。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在相對分子量40KD(融合蛋白)處有明顯的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶，3