Cofilin在成骨細胞力學信號轉導中的作用研究.pdf

1、正常骨骼處于一個吸收與重建的動態(tài)平衡狀態(tài)中,其中力刺激是維持平衡的基礎。不斷有研究證實,牽張應力是有效促進成骨活性和功能的力學刺激。體內(nèi)外力刺激通過多種途徑被成骨細胞所感知,通過一系列的級聯(lián)網(wǎng)絡反應,成骨細胞將力學信號轉化為生物學信號,進一步調(diào)節(jié)相關基因的表達水平,同時合成各種活性物質及酶類,最終使得機體表現(xiàn)出各種復雜的生理及病理活動。多種信號轉導途徑中,細胞骨架作為首先感受力學刺激的結構,發(fā)揮著重要作用。成骨細胞對外源性機械力信號的反

2、應主要是由F-actin來響應的,F-actin通過與跨膜分子相互作用而成為跨膜力信號傳遞的主要環(huán)節(jié)。而成骨細胞細胞骨架的改建依賴于一些對力學敏感的關鍵蛋白的調(diào)控作用。ADF/Cofilin家族蛋白是actin結合蛋白中獨一無二的解聚微絲的蛋白群,其對肌動蛋白發(fā)揮著重要調(diào)控作用:當肌動蛋白絲激活時,ADF/Cofilin家族蛋白能夠切斷肌動蛋白絲,增加肌動蛋白單體在肌絲末端的解聚合。這提示我們Cofilin在細胞骨架力學轉導信號中發(fā)揮著

3、重要作用。而以往的研究主要集中在內(nèi)皮、神經(jīng)、肌肉細胞中,對于成骨細胞的研究尚未見報道。
　　本實驗通過Flexcell應力加載系統(tǒng),對人成骨樣細胞(MG-63)施以不同加載時長的周期性牽張力,通過免疫熒光、RT-PCR、Western Blot、基因沉默等技術,探討MG-63細胞受牽張力刺激后Cofilin的表達情況,以及在Cofilin正常表達與Cofilin抑制后,對上下游的成骨目的基因的影響,從而探討Cofilin在機械力學

4、刺激下細胞信號轉導中的作用,為骨力學轉導機制提供新的依據(jù),為縮短牽張成骨時程、加速骨缺損修復開辟新的思路,并為篩選治療骨代謝失衡相關疾病的藥物提供新靶點。
　　1.牽張應力下Cofilin在成骨細胞中表達變化的實驗研究
　　目的:應用機械牽張應力加載人成骨肉瘤細胞MG-63,通過觀察和測定絲切蛋白(Cofilin)的表達和含量變化情況,初步探討Cofilin在牽張應力引起的MG-63細胞力學信號轉導過程中的作用。
　　

5、方法:將MG-63分為加力組與對照組,對照組不加力,采用Flexcell牽張應力加載系統(tǒng),用12％大小的應力值進行力學刺激1、4、8、12、24h后,用免疫熒光染色觀察Cofilin的變化,RT-PCR檢測CofilinmRNA水平的變化,Western-Blot測定細胞內(nèi)Cofilin的含量。
　　結果:MG-63細胞受應力刺激后,1、4h細胞內(nèi)Cofilin染色逐漸增強,8、12、24h細胞內(nèi)Cofilin染色逐漸減弱,但仍明

6、顯高于對照組。而應力作用下CofilinmRNA水平無明顯變化(p>0.05)。WesternBlot顯示,加載后1hCofilin含量增高(p<0.05),4h時細胞內(nèi)Cofilin含量達到高峰(p<0.05),8、12、24hCofilin含量逐漸減少,但仍明顯高于對照組(p<0.05)。
　　結論:機械牽張應力刺激可明顯上調(diào)Cofilin表達,且具有時間依賴性,提示其可能在成骨細胞力學信號轉導過程中發(fā)揮一定的作用。
　

7、　2.構建Cofilin蛋白低表達模型
　　目的:為了進一步明確Cofilin的作用,本實驗采取shRNA干擾載體構建Cofilin低表達模型,為下一步實驗明確應力下Cofilin正常表達以及干擾后Cofilin對成骨分化及成骨相關基因mRNA表達的影響。
　　方法:委托公司設計Cofilin基因沉默的不同shRNA片段,通過對MG-63細胞轉染,熒光顯微鏡下觀察細胞轉染情況,RT-PCR檢測轉染后CofilinmRNA水平

8、變化,Westernblot測定細胞內(nèi)Cofilin的含量。
　　結果:4個干擾片段在mRNA水平上明顯降低了Cofilin的水平(p<0.05),但各片段之間無明顯差異(p>0.05)。Western blot結果顯示,1號和4號片段明顯下調(diào)了Cofilin的含量(p<0.001)。
　　結論:1號與4號shRNA干擾載體可明顯抑制Cofilin的表達,且效果穩(wěn)定。
　　3.Cofilin對機械應力引起的成骨細胞成骨

9、效應的影響
　　目的:通過觀察正常表達Cofilin的成骨樣細胞與抑制表達Cofilin成骨樣細胞在機械力學刺激下對成骨分化及成骨相關基因的mRNA水平的影響,從而明確Cofilin在機械力學刺激成骨中的作用,探討Cofilin在促進機械應力介導的成骨細胞成骨效應的上下游分子機理,為成骨細胞力學信號轉導機制提供新的證據(jù)。
　　方法:細胞分為Cofilin正常表達與Cofilin抑制組,正常表達組分組方式與加力方式均同實驗一,

10、Cofilin抑制組采用實驗二中篩選出的1號干擾片段,創(chuàng)建模式同實驗二,加力組分組方法同實驗一,對照組為不干擾,不加力。力學加載完成后采用Realtime-PCR方法檢測成骨及成骨分化的目的基因ALP、OCN、COL1、Runx-2mRNA水平的變化。
　　結果:Cofilin正常表達組在力學刺激后ALP、OCN、COL1、Runx-2基因的mRNA水平有明顯變化,均顯著高于對照組(p<0.05),Cofilin抑制后,機械力學刺