腺病毒介導的膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子基因通過Wnt信號通路誘導骨髓間充質干細胞向神經樣細胞分化.pdf

1、目的:
　　觀察腺病毒介導的膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子(GDNF)基因對大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)向神經樣細胞分化的影響，并進一步研究Wnt信號通路在骨髓間充質干細胞向神經樣細胞分化中的作用。
　　方法:
　　分離、培養(yǎng)BMSCs，流式細胞儀鑒定其細胞表型分子CD11b、CD34、CD29、CD90。將第3代培養(yǎng)的BMSCs分為3組:轉染組、DKK-1組、對照組。轉染組以載膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子和綠色熒光蛋白基

2、因重組腺病毒(AD-GDNF-GFP)轉染BMSCs，DKK-1組以AD-GDNF-GFP轉染BMSCs同時加入DKK-1以阻斷Wnt信號通路，對照組僅以含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。于轉染后第1、5、7、14天熒光顯微鏡下觀察BMSCs對綠色熒光蛋白GFP的表達情況并以Western blot技術檢測轉染組BMSCs對GDNF蛋白的表達情況。MTT法測定轉染后BMSCs活力。于轉染后以免疫熒光技術檢測BMSCs對神經特異性蛋白N

3、SE、MAP-2、β-TublinⅢ的表達情況。RT-PCR檢測BMSCs對神經營養(yǎng)因子bFGF、EGF、BDNF、NT-3基因的表達情況。為探討Wnt信號通路在腺病毒介導的膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子基因誘導BMSCs神經分化過程中的作用，轉染后以免疫熒光、蛋白質印跡技術檢測β-catenin、NSE的表達情況，并應用RT-PCR法進一步檢測Wnt信號通路相關分子Wnt1a、Wnt3a、Wnt7a基因表達水平。
　　結果:
　

4、　第3代培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞呈魚群樣、漩渦狀貼璧生長，高表達CD29、CD90，陽性率分別為99.8％、95.6％;低表達CD11b、CD34，且陽性率分別為1.4％，1.5％。載GDNF基因重組腺病毒轉染BMSCs24小時后，在熒光顯微鏡下即可觀察到綠色熒光蛋白GFP的表達，隨著時間的延長熒光蛋白GFP的熒光強度逐漸增強，轉染7天后綠色熒光蛋白GFP的熒光強度最高，轉染后14天熒光強度明顯減弱。分別于轉染后第1天、3天、7天、14天

5、以Western Blot技術均可檢測到GDNF蛋白的表達。轉染后5天，免疫熒光技術檢測結果顯示轉染組BMSCs表達NSE，轉染后10天MAP-2、β-TublinⅢ呈陽性表達，且多數(shù)細胞呈典型的神經細胞形態(tài)，胞體明顯皺縮并向周圍形成突起。而對照組均未見NSE、MAP-2、β-Tub linⅢ表達。轉染5天后免疫熒光技術檢測發(fā)現(xiàn)轉染組β-catenin、NSE呈陽性表達，而DKK-1組β-catenin熒光強度明顯低于對照組，對照組未見

6、β-catenin表達，且DKK-1組、對照組無NSE表達。RT-PCR檢測結果表明，轉染組Wnt信號通路相關分子Wnt1a、Wnt3a、Wnt7a基因表達量明顯上調，與DKK-1組及對照組比較存在明顯差異，且有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　(1)腺病毒介導的膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子基因可以促進骨髓間充質干細胞表達神經元標志蛋白，能誘導其向神經樣細胞分化;
　　(2)腺病毒介導的膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子