血小板源mir-92a，胱抑素C與Ⅱ型糖尿病下肢缺血的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　能夠引起下肢動(dòng)脈缺血的主要疾病有動(dòng)脈硬化閉塞癥、血栓閉塞性脈管炎以及糖尿病下肢血管病變，糖尿病病人一旦出現(xiàn)了下肢缺血的癥狀，不但治療起來(lái)極其困難，而且面臨感染、缺血壞死甚至致殘及致死的危險(xiǎn);疾病發(fā)病早期主要表現(xiàn)為患肢怕冷、皮膚麻木以及針刺感，趾尖和趾甲明顯增厚、足部蒼白，足背動(dòng)脈及脛后動(dòng)脈搏動(dòng)減弱或消失，接著出現(xiàn)間歇性跛行，行走一段距離必須停下休息片刻方可繼續(xù)行走。疾病進(jìn)一步發(fā)展，在上述癥狀逐漸加重，跛行距離越來(lái)越短，

2、并出現(xiàn)靜息痛。疾病晚期主要表現(xiàn)為足趾、內(nèi)外踝、足跟、足底等末梢部位逐漸出現(xiàn)皮膚及軟組織發(fā)黑、壞死，并在壞死的基礎(chǔ)上發(fā)生感染，形成潰爛，甚至出現(xiàn)骨髓炎;這些情況逐漸加重甚至需要截肢，有時(shí)可以危及生命。為了避免糖尿病的這些下肢的嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，應(yīng)該做好糖尿病下肢血管病變的早期發(fā)現(xiàn)及診斷工作。
　　周圍血管疾病可以導(dǎo)致下肢缺血，下肢缺血可以表現(xiàn)為患足潰瘍和缺血壞死，嚴(yán)重的甚至可以導(dǎo)致截肢，嚴(yán)重影響病人的生存質(zhì)量。早期糖尿病可能伴隨

3、著血管畸形及血栓斑塊形成。糖尿病下肢缺血經(jīng)常發(fā)生在嚴(yán)重糖尿病病史的病人，早期缺血的病人并沒(méi)有明顯的癥狀，然而一旦出現(xiàn)的臨床癥狀，患者的血管便會(huì)出現(xiàn)不可逆的病理?yè)p害，從而導(dǎo)致治療復(fù)雜。因此糖尿病下肢缺血的早期診斷，對(duì)于降低糖尿病下肢缺的風(fēng)險(xiǎn)，保證病人的生活質(zhì)量血非常有意義。一個(gè)回顧性研究顯示系統(tǒng)性的炎癥因子C反應(yīng)蛋白質(zhì)(CRP)可能作為一個(gè)PAD的早期診斷標(biāo)志。然而CRP診斷PAD的特異性太差，從而導(dǎo)致他的應(yīng)用的局限性。
　　半胱氨

4、酸蛋白質(zhì)酶抑制劑Cystatin C是120氨基酸殘基組成，并在所有生物包括植物、動(dòng)物、無(wú)脊椎生物中存在。Cystatin C由人類第20號(hào)染色體短臂13區(qū)2帶編碼。該基因有4.3 kb長(zhǎng)，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，可能在所有的有核生物中持續(xù)的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在生理狀態(tài)下，Cystatin C能夠抑制內(nèi)生的半胱氨酸蛋白質(zhì)酶活性。以往的研究表明Cystatin C是一個(gè)評(píng)估早期腎損傷的指標(biāo);然而最近的研究表明Cystatin C的異常表達(dá)同

5、心血管疾病有顯著的相關(guān)性（包括高血壓、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病下肢缺血）。研究現(xiàn)CystatinC的表達(dá)水平同糖尿病伴有下肢缺血程度相關(guān)，高表達(dá)的Cystatin C提示糖尿病伴有下肢缺血癥的風(fēng)險(xiǎn)增加。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一組小的非編碼RNA，由18-22核苷酸組成，能夠干擾轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，另外，它能夠參加大量的信號(hào)通路，miRNAs廣泛表達(dá)于體液包括血液（血漿、血小板、紅細(xì)胞、單核細(xì)胞）和尿液，同時(shí)它不

6、會(huì)被內(nèi)源性RNA聚合酶降解。另外，大量的報(bào)道顯示:miRNAs可以作為分子信號(hào)作用于細(xì)胞間的信號(hào)通路。miRNAs在心血管細(xì)胞的發(fā)育、再生、遷移、凋亡、代謝、破壞、修復(fù)以及表型轉(zhuǎn)化。許多的心血管疾病都與miRNA有關(guān)，比如冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心肌梗死、心力衰竭、高血壓病、心律失常、心急纖維化和心急肥厚等。不僅如此，miRNA具有組織、病理和正常狀態(tài)下的敏感性和特異性，是理想的生物標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)。在動(dòng)脈粥樣硬化的形成過(guò)程中，血小板粘附

7、在血管壁，并釋放大量的調(diào)節(jié)因子，其中包括miRNAs，從而加速了相關(guān)疾病的進(jìn)程。
　　本研究的目的在于發(fā)現(xiàn)miR-92a和Cystatin C之間的關(guān)系，以及miR-92a和Cystatin C的表達(dá)水平與糖尿病下肢缺血之間的關(guān)聯(lián)，另外，miR-92a聯(lián)合Cystatin C檢查或許能夠成為早期診斷糖尿病下肢缺血的一個(gè)臨床檢驗(yàn)指標(biāo)。
　　方法：
　　1.分組
　　患者均選自2012年5月至2013年12月的Ⅱ型糖

8、尿病的患者，并根據(jù)踝肱指數(shù)(ABI)分為以下3組:單純Ⅱ型糖尿病組(T2DM; n=60);Ⅱ型糖尿病伴有輕到中度的下肢動(dòng)脈閉塞組(LLI-LM; n=70);還有Ⅱ型糖尿病伴有重度下肢動(dòng)脈閉塞組(LLI-S; n=69)。各組的性別構(gòu)成如下:T2DM組，30個(gè)男性，30個(gè)女性;LLI-LM組40個(gè)男性，30個(gè)女性;LLI-S組，38個(gè)男性，31個(gè)女性。另外有60個(gè)門診病人被隨機(jī)選入作為健康對(duì)照組，32個(gè)男性，28個(gè)女性。并排除糖尿?。?/p>

9、應(yīng)用糖耐量檢測(cè)），高血壓，其他內(nèi)分泌及代謝性疾病，也排除了家族糖尿病病史。另外，4組病人均排除了感染，糖尿病酮癥酸中毒，血液系統(tǒng)疾病，癌癥病史，激素應(yīng)用史及手術(shù)史。本研究獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，所有的標(biāo)本的采集與用途均獲得本人的知情并簽署同意書。
　　2.檢測(cè)病人的臨床數(shù)據(jù)及生化指標(biāo)
　　所有患者均測(cè)身高、體重、腰圍、臀圍、收縮壓、舒張壓，計(jì)算體重指數(shù)、腰臀比。用免疫透射比濁法測(cè)定Cystatin C（上海北加醫(yī)療器械有限

10、公司），總膽固醇(Total cholesterol，TC)應(yīng)用氧化酶法來(lái)檢測(cè);甘油三酯(Triglyceride，TG)用GPO酶法來(lái)檢測(cè);用均相酶比色法測(cè)定高密度脂蛋白質(zhì)膽固醇(Highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C)同低密度脂蛋白質(zhì)膽固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C);空腹血糖(FPG)同樣用氧化酶法來(lái)測(cè)定。采用高壓液相層析技術(shù)檢測(cè)糖

11、化血紅蛋白質(zhì)(Hemoglobin A1C，HbA1c)。采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定空腹胰島素(FINS)。胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis modelassessment of insulin resistance)可以用采用穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估法進(jìn)行評(píng)定:(HOMA-IR)=FINS(mU/L)×FPG(mmol/L)/22.5。所有患者采用飛利浦IU22多普勒超聲儀測(cè)定雙側(cè)肢體ABI，ABI=踝動(dòng)脈收縮壓/肱動(dòng)脈收縮壓。
　　這一步是

12、為了觀察比較各組各項(xiàng)臨床數(shù)據(jù)及生化指標(biāo)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，進(jìn)一步明確其相關(guān)關(guān)系，印證Cystatin C與糖尿病缺血的相關(guān)性。
　　3.少白細(xì)胞血小板(LDP)的制備和SYBR Green(熒光定量實(shí)時(shí)PCR)fluorescencequantitative RT-PCR
　　取各組外周血血樣加入枸櫞酸葡萄糖，然后并以80g離心處理10分鐘。取2mM乙二胺四乙酸EDTA加入富血小板血漿(PRP)，再以1000g離心處理10mi

13、n使血小板沉淀，將其放入3 ml bead buffer中再懸浮，加入40μ l human CD45MicroBeads試劑，并以室溫孵化45分鐘并輕柔混勻。應(yīng)用MACS magnetic beadseparation system(Miltenyi Biotec，Germany)分離LDP獲取的血小板純度高達(dá)99.99％以上。
　　應(yīng)用TRIzol試劑提取總RNAs。應(yīng)用M-MLV(Takara，Dalian，China)總R

14、NAs反轉(zhuǎn)錄試劑轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行熒光定量實(shí)時(shí)PCR。引物序列如下:Cystatin C上游引物:AGATCTACGCTGTGCCTTGG;Cystatin C下游引物:CAGAGCCTGTGGGGTAAACA; miR-92a: ACTATTGCACTTGTCCCG。反應(yīng)條件為:12.5μ lSYBR Premix Ex Taq(Takara, Dalian, China),1μ lPCR Forward Primer,1

15、μ lUni-miR qPCR Primer,2μ lcDNA template, and8.5μ lddH2O，總共25μ l，每個(gè)樣本分成3分。基因擴(kuò)增的條件和程序如下:預(yù)變性過(guò)程95℃，30 s，然后40次重復(fù)95℃，5s;60℃，20 s。應(yīng)用2-△△T±SEM來(lái)計(jì)算相應(yīng)的miRNA表達(dá)水平。U6基因用做內(nèi)參控制基因。
　　這一步是為了檢測(cè)各組LDP中miRNA-92a表達(dá)水平，從而明確miRNA-92a同糖尿病下肢缺血的

16、嚴(yán)重程度是否相關(guān)。以及后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后進(jìn)行定量分析明確miR-92a和Cystatin C之間的調(diào)控關(guān)系。
　　結(jié)論：
　　該研究表明，我們應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)調(diào)節(jié)Cystatin C的基因，最后發(fā)現(xiàn)，miRNA-92a可能是調(diào)節(jié)Cystatin C表達(dá)的目標(biāo)基因。轉(zhuǎn)染miR-92a到內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-92a能夠調(diào)節(jié)cystatinC的表達(dá)。這提示我們，在動(dòng)脈粥樣硬化的病理變化過(guò)程中，血小板可能釋放了miR-92a直接作

17、用于內(nèi)皮細(xì)胞，并通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞間的反應(yīng)去調(diào)節(jié)Cystatin C的表達(dá)。此外，我們檢查了NC組，T2DM組，LLI-LM組，和LLI-S組等各組病人血小板中miR-92a的表達(dá)水平，數(shù)據(jù)分析表明，血小板源miR-92a與病人血清Cystatin C的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。特別是，miR-92a在糖尿病伴有嚴(yán)重缺血的病人中表達(dá)很低，同時(shí)血清Cystatin C的表達(dá)保持在高位水平。顯而易見，該結(jié)果表明，通過(guò)結(jié)合監(jiān)測(cè)血小板源miR-92a和血清Cy