細(xì)絲蛋白B在基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖和遷移中的功能研究.pdf

1、細(xì)絲蛋白B(Filamin B，F(xiàn)LNB)由第3號(hào)常染色體上的基因編碼，是細(xì)胞骨架蛋白，它與肌動(dòng)蛋白交聯(lián)形成三維細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)并維持細(xì)胞形態(tài)，在細(xì)胞中參與多種生理生化活動(dòng)，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞增殖等。近年來(lái)的研究表明，細(xì)絲蛋白A和細(xì)絲蛋白B在腫瘤發(fā)生、骨骼疾病、細(xì)胞遷移以及粘附過(guò)程中起關(guān)鍵作用;本實(shí)驗(yàn)室以前的研究表明，細(xì)絲蛋白A(FLNA)能夠抑制RNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ)指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，并且通過(guò)細(xì)胞特異性的調(diào)節(jié)方式抑制RNA聚合酶Ⅲ(Po

2、lⅢ)指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。由于FLNB和FLNA都屬于細(xì)絲蛋白家族，初級(jí)結(jié)構(gòu)上具有80％的同源性，且在細(xì)胞內(nèi)共定位，因此，在本課題中，我們?cè)噲D了解FLNB是否也參與PolⅠ和PolⅢ基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程并影響細(xì)胞的增殖和遷移功能。
　　為了完成以上研究目標(biāo)，首先，我們制備了FLNB shRNA慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，利用制備的慢病毒表達(dá)顆粒侵染293T和HeLa細(xì)胞并篩選出FLNB shRNA穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。利用RT-qPCR分析這

3、些細(xì)胞系中PolⅠ和PolⅢ指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，結(jié)果表明，F(xiàn)LNB敲低能夠顯著降低所檢測(cè)的一部分基因的RNA表達(dá)水平;提示FLNB是PolⅠ和PolⅢ指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄所需要的。為了確定這一發(fā)現(xiàn)，利用293T和HeLa細(xì)胞過(guò)表達(dá)FLNB，結(jié)果表明，F(xiàn)LNB過(guò)表達(dá)顯著增加核糖體RNA，U6snRNA以及7SL RNA表達(dá)水平。這些結(jié)果證明FLNB是維持PolⅠ和PolⅢ正?；蜣D(zhuǎn)錄所必需的。由于FLNA敲低能促進(jìn)細(xì)胞中PolⅠ和PolⅢ基因轉(zhuǎn)錄，

4、因此，在FLNB敲低的基礎(chǔ)上再次敲降FLNA是否挽救因FLNB敲低導(dǎo)致的基因表達(dá)抑制，利用FLNB-FLNA雙敲低細(xì)胞系以及qPCR方法，數(shù)據(jù)表明，一部分受FLNB敲低抑制的基因的表達(dá)水平有不同程度的上調(diào)。這一結(jié)果提示FLNB與FLNA在調(diào)控PolⅠ和PolⅢ基因轉(zhuǎn)錄功能上起著相反的作用。
　　由于PolⅠ和PolⅢ基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖密切相關(guān)，因此，我們?cè)噲D確定FLNB表達(dá)水平的改變是否影響細(xì)胞增殖。通過(guò)對(duì)上述細(xì)胞株在不同時(shí)間進(jìn)行

5、細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LNB敲低抑制細(xì)胞增殖，而FLNB過(guò)表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞的增殖。FLNB是否調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移還不清楚，因此我們通過(guò)細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)分析FLNB表達(dá)水平的改變對(duì)上述細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)LNB敲低抑制細(xì)胞遷移，而FLNB過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞遷移。進(jìn)一步對(duì)FLNA敲低細(xì)胞系及FLNB-FLNA雙敲低細(xì)胞系的增殖和遷移功能的分析表明，在293T、HeLa細(xì)胞中，F(xiàn)LNA與FLNB在調(diào)控細(xì)胞增殖和遷移功能

6、上起相反的作用;FLNA抑制細(xì)胞增殖和遷移，而FLNB促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。與FLNB敲低細(xì)胞系相比，雖然FLNB-FLNA雙敲低細(xì)胞系的增殖水平表現(xiàn)出一定程度升高，但雙敲低細(xì)胞系的遷移能力則表現(xiàn)出的下降趨勢(shì)。這一結(jié)果顯示，當(dāng)同時(shí)敲低293T、HeLa細(xì)胞中的FLNB后再敲低FLNA，F(xiàn)LNA在細(xì)胞遷移方面起正調(diào)控作用，提示FLNA對(duì)細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)作用依賴于FLNB的表達(dá)。綜合以上數(shù)據(jù)，本課題發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LNB是維持細(xì)胞PolⅠ和PolⅢ正常