自噬在大鼠聽皮層退行性變過程中的作用及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、本文分為以下兩個(gè)部分:
　　第一部分:聽皮層早衰大鼠模型的建立
　　目的:通過注射D-半乳糖建立大鼠聽皮層早衰模型。
　　方法:1月齡Sprague Dawley(SD)大鼠180只，隨機(jī)分為兩組：實(shí)驗(yàn)組為擬老化組，連續(xù)8周進(jìn)行D-半乳糖500mg/kg/d頸背部皮下注射的處理；對(duì)照組為生理鹽水組，同樣連續(xù)處理8周，每天對(duì)大鼠進(jìn)行頸背皮下注射，給予與D-半乳糖組同等體積的生理鹽水（每100g大鼠體重注射的生理鹽水體積與

2、D-半乳糖組每100g大鼠體重注射的D-半乳糖體積一樣）。注射期間注意每天對(duì)注射部位消毒處理。8周注射結(jié)束后，將D-半乳糖組和生理鹽水組再各分為3個(gè)小組，分別是3月齡組（注射結(jié)束后0個(gè)月）、9月齡組（注射結(jié)束后6個(gè)月）和15月齡組（注射結(jié)束后12個(gè)月）。每個(gè)亞組30只SD大鼠。造模結(jié)束后，對(duì)每只大鼠的聽力通過聽性腦干反應(yīng)（Auditory Brainstem Response,ABR）進(jìn)行檢測(cè)；大鼠聽皮層線粒體DNA的常見缺失（CD）水

3、平通過RT-PCR技術(shù)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)；大鼠聽皮層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的退行性改變通過透射電鏡觀察研究；聽皮層神經(jīng)元密度的變化采用甲苯胺藍(lán)染色法觀察記錄；通過TUNEL染色以及蛋白印跡、免疫熒光法檢測(cè)聽皮層細(xì)胞凋亡水平。
　　結(jié)果：ABR檢測(cè)結(jié)果顯示聽閾隨著年齡的增長(zhǎng)而升高，擬老化組與同月齡、相同頻率（4kHz、8kHz、16kHz、24kHz、32kHz）的對(duì)照組比較，閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；D-半乳糖組mtDNA CD與同齡

4、對(duì)照組相比升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在3、9月齡時(shí)P<0.05，15月齡時(shí)P<0.01；在對(duì)照組內(nèi)，15月齡較3月齡CD水平明顯升高（P<0.01），D-半乳糖組內(nèi)，15月齡同3月齡相比，CD水平明顯升高（P<0.01）。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，同月齡的擬老化組與對(duì)照組大鼠相比，細(xì)胞核變形，染色質(zhì)固縮，線粒體腫脹變形、數(shù)量減少，脂褐素沉積，神經(jīng)纖維脫髓鞘樣變等細(xì)胞衰老的超微結(jié)構(gòu)病理變化出現(xiàn)時(shí)間較早，并且退行性變更加顯著；甲苯胺藍(lán)神經(jīng)元染色

5、結(jié)果顯示，15月齡時(shí)，擬老化組大鼠與自然老化組大鼠相比，聽皮層神經(jīng)元密度明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；TUNEL染色以及Western blotting、免疫熒光結(jié)果表明，擬老化組大鼠聽皮層TUNEL陽(yáng)性數(shù)目以及Cleaved CASP3蛋白表達(dá)水平與同月齡的自然老化組大鼠聽皮層相比，在3月齡時(shí)無(wú)明顯差異，但是在9、15月齡時(shí)，細(xì)胞凋亡水平明顯增加。
　　結(jié)論:D-半乳糖長(zhǎng)期慢性處理導(dǎo)致大鼠聽皮層線粒體DNA常見缺

6、失累積；聽皮層神經(jīng)元密度下降、神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)退行性變過早出現(xiàn)；聽皮層細(xì)胞凋亡水平升高。D-半乳糖加速了聽皮層細(xì)胞衰老的進(jìn)程，促進(jìn)了老年性聾的發(fā)生。
　　第二部分:觀察大鼠聽皮層中自噬水平隨著年齡的變化及自噬在聽皮層衰老中的作用并探討AMPK-mTOR-ULK1信號(hào)通路對(duì)自噬的調(diào)控機(jī)制
　　目的:老年性聾已成為嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量的重要疾病因素之一，但是到目前為止老年性聾的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。自噬已被證實(shí)在多種疾病中的發(fā)生

7、發(fā)展過程中起到重要作用，近年來(lái)自噬在神經(jīng)退行性疾病中的研究越老越多，但在中樞性老年性聾方面卻未見相關(guān)研究。本研究的目的是觀察自噬在大鼠聽皮層的退化過程中的變化及其作用，以及對(duì)自噬相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究。
　　方法：1月齡SD大鼠180只隨機(jī)分為兩組：其中實(shí)驗(yàn)組大鼠連續(xù)8周給予頸背皮下注射D-半乳糖500mg/kg/d；對(duì)照組為生理鹽水組，同樣連續(xù)處理8周，每天對(duì)大鼠進(jìn)行頸背皮下注射，注射劑量根據(jù)體重計(jì)算，體積同D-半乳糖。注射期間注意

8、每天對(duì)注射部位消毒處理。8周注射結(jié)束后，將D-半乳糖組和生理鹽水組再各分為3個(gè)小組，分別是3月齡組（注射結(jié)束后0個(gè)月）、9月齡組（注射結(jié)束后6個(gè)月）和15月齡組（注射結(jié)束后12個(gè)月）。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因LC3、BECN1和凋亡相關(guān)基因BAX，BCL-XL，BCL2的mRNA表達(dá)水平；Western blotting檢測(cè)LC3、BECN1、p62、BAX、BCL-XL、BCL2和AMPK-mTOR-ULK1信號(hào)通路相關(guān)蛋白P-

9、AMPK、P-mTOR、P-ULK1、Atg13、P-4EBP1、Atg5、Atg7的蛋白表達(dá)；免疫熒光技術(shù)檢測(cè)LC3、BECN1、p62和BCL2在聽皮層的定位及表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果：對(duì)自噬相關(guān)基因及凋亡相關(guān)基因mRNA通過RT-PCR檢測(cè)表明，與自然老化組相比，擬老化組LC3mRNA水平在3月齡、9月齡分別上升了1.52倍（P<0.05）和1.64倍（P<0.05）；BECN1mRNA水平在3月齡上升了1.84倍（P<0

10、.05）；在15月齡，和自然老化組相比，擬老化組LC3、BECN1mRNA水平分別下降了1.35倍（P<0.05）和1.21倍（P<0.05）；促凋亡基因BAX在9、15月齡mRNA分別上升了1.45倍（P<0.05）和1.70倍（P<0.01）；抗凋亡基因BCL-XL在3月齡升高了1.47倍（P<0.05），在15月齡降低了0.76倍（P<0.05）；BCL2在3月齡、9月齡分別升高了1.94倍（P<0.01）和1.6倍（P<0.05

11、），在15月齡降低了2.1倍（P<0.01）。Western blotting結(jié)果顯示，較同齡對(duì)照組相比，擬老化組聽皮層自噬相關(guān)蛋白LC3-II在3月齡、9月齡分別升高了2.56倍（P<0.05），1.93倍(P<0.05)；在15月齡下降了1.96倍(P<0.01)。BECN1在3月齡升高了1.74倍(P<0.01)；在15月齡下降了1.24倍(P<0.05)。較同齡對(duì)照組相比，自噬降解底物p62在擬老化組3、9月齡明顯降低，分別下降

12、了2.41，1.75倍，在15月齡升高了1.20倍。此外，和同齡自然老化組相比，擬老化組促凋亡蛋白BAX在9、15月齡分別上升了1.8倍（P<0.05）和5.86倍(P<0.001)?？沟蛲龅鞍譈CL2在擬老化組大鼠聽皮層表達(dá)水平在3月齡和9月齡均明顯升高，分別升高了2.4倍（P<0.001）和2.36倍(P<0.01)；在15月齡時(shí)，擬老化組BCL2明顯下降，下降了3.67倍(P<0.001)?？沟蛲龅鞍譈CL-XL在3月齡時(shí)擬老化組

13、較對(duì)照組升高了1.5倍（P<0.05），15月齡時(shí)，下降了1.9倍（P<0.05）。此外，較對(duì)照組相比，BCL-XL/BAX在擬老化組3月齡上升了1.83倍（P<0.05），在9月齡、15月齡分別下降了1.67倍（P<0.05），8.3倍（P<0.001）；BCL2/BAX在3月齡明顯上升了3.4倍（P<0.01），在15月齡明顯降低了10.6倍（P<0.001）。Western blotting對(duì)AMPK-mTOR-ULK1信號(hào)通路相

14、關(guān)蛋白檢測(cè)表明,與同齡對(duì)照組相比，擬老化組P-AMPK在3月齡升高了1.47倍（P<0.01）,在9月齡、15月齡分別降低了6.64倍（P<0.001）和6.05倍（P<0.001）；P-mTOR和P-ULK1在3月齡分別降低了1.33倍（P<0.05）和2.02倍（P<0.001）,在9月齡分別升高了5.05倍（P<0.001）和1.36倍（P<0.01），在15月齡分別升高了1.75倍（P<0.01）和1.26倍（P<0.05）；A

15、tg13在3月齡、9月齡分別升高了1.13倍（P<0.05）和2.24倍（P<0.01），在15月齡降低了1.35倍。免疫熒光結(jié)果顯示，LC3和BECN1蛋白表達(dá)量在3月齡擬老化組較同齡對(duì)照組明顯升高(P<0.001,P<0.01)，在15月齡時(shí)明顯降低(P<0.001,P<0.01)；較同齡對(duì)照組相比，擬老化組p62在3月齡明顯降低（P<0.01），在15月齡明顯升高（P<0.01）；BCL2在3月齡(P<0.01)、9月齡(P<0.

16、05)擬老化組較同齡對(duì)照組均明顯升高，15月齡時(shí)較對(duì)照組明顯降低（P<0.001）。此外，Western blotting結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)中，4EBP1活性與自噬活性的改變沒有明顯相關(guān)性。
　　結(jié)論：自噬水平在大鼠聽皮層隨著年齡的增長(zhǎng)而改變，從青年到中年，自噬水平呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，到老年時(shí)下降，并且和抗凋亡蛋白BCL2、BCL-XL協(xié)同抵抗細(xì)胞凋亡。在D-半乳糖誘導(dǎo)的擬老化組，3月齡時(shí)，自噬水平代償性升高，起到了保護(hù)作用；9月齡時(shí)