急性肺損傷大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞TMEM16A的表達研究.pdf

1、目的：急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是機體遭受各種打擊時引起的以肺泡毛細血管通透性增加為特征的肺部炎癥綜合征，發(fā)病急、病情重，未經(jīng)有效治療可以發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratorydistress syndrome，ARDS)。臨床表現(xiàn)為難治性低氧血癥、非心源性肺水腫、肺動脈高壓而體循環(huán)低血壓。盡管目前對其治療措施已有很大進展，其死亡率仍在50％左右。急性肺水腫(acute pulmona

2、ry edema，APE)是ALI/ARDS的主要病理生理特點。臨床研究表明：早期清除ARDS患者肺泡內(nèi)的液體是其治療的關(guān)鍵。肺泡液體清除率(alveolar nuid clearanceAFC)與肺水腫關(guān)系密切，肺泡上皮細胞轉(zhuǎn)運功能正常對于肺水的清除十分重要，增加肺泡液體清除率可以促進肺水腫的吸收。肺泡液體清除是肺泡上皮的主要功能之一。
　　肺泡上皮細胞由扁平的肺泡Ⅰ型細胞(ATⅠ)和立方形的肺泡Ⅱ型細胞(ATⅡ)組成，其主要功

3、能在于清除肺泡內(nèi)多余液體，保持肺泡相對干燥，維持氣體的正常交換。肺泡上皮細胞上存在的多種離子通道參與了肺水的液體轉(zhuǎn)運。在眾多的離子通道中鈉離子通道對于肺泡液體清除的作用已經(jīng)被證實。水通道也己被證實存在于ATⅡ，且水通道蛋白1(AQP1)在ARDS狀態(tài)下表達顯著下降，朱麗華等在實驗中證實水通道蛋白4(AQP4)在ARDS狀態(tài)下表達增加。盡管氯離子通道在體內(nèi)含量豐富，但是關(guān)于其與肺泡液體清除的研究卻很少。囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)體(Cysti

4、c Fibrosis Trans-membrane conductance Regulator CFTR)氯離子通道是一種cAMP依賴性蛋白激酶和ATP調(diào)節(jié)的氯離子通道，已被證實存在于肺泡上皮細胞。谷秀等研究發(fā)現(xiàn)β-受體激動劑和CFTR通道激動劑均可提高離體大鼠的AFC，且前者提高AFC的作用部分是通過CFTR完成的。多項研究表明CFTR在肺泡液體的清除過程中發(fā)揮作用。但最近發(fā)表的報道未顯示β2-受體激動劑改善ARDS預(yù)后的效應(yīng)，說明影

5、響因素復(fù)雜。
　　TMEM16A是在2008被發(fā)現(xiàn)的鈣激活的氯離子通道，其在ALI中的作用尚未被人們所了解，本實驗中選取TMEM16A為研究對象。通過靜脈注射LPS建立ALI模型，分離并純化ATⅡ，并在細胞水平檢測TMEM16A的表達變化。
　　方法：選取清潔級健康雄性SD大鼠24只，體重在180-220g，將其隨機分為2組：正常對照組，LPS模型組。每組6只大鼠用于肺組織病理學(xué)檢查，6只用于檢測TMEM16A的表達。LPS

6、組經(jīng)尾靜脈注射LPS(8 mg/kg)，對照組注射生理鹽水，2小時后取材。麻醉后經(jīng)股動脈放血取新鮮肺組織。取左肺葉用10％福爾馬林溶液固定留作病理觀察。按照經(jīng)典的方法并加以改進提取ATⅡ。將大鼠麻醉后行氣管切開，經(jīng)肺動脈插管，行肺動脈灌洗的同時行肺通氣。之后將肺組織移出胸腔，用胰蛋白酶和膠原酶對肺組織進行消化。之后剪碎肺組織，過濾細胞懸液。對細胞懸液進行離心并調(diào)節(jié)細胞濃度，進行體外培養(yǎng)。應(yīng)用IgG免疫粘附法純化ATⅡ，應(yīng)用電鏡觀察和AK

7、P染色法對ATⅡ進行鑒定。通過酶聯(lián)免疫吸附法測定細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β的水平，免疫印跡法檢測TMEM16A的表達。
　　結(jié)果：1病理結(jié)果：正常組HE染色可見肺結(jié)構(gòu)完整，各處肺泡間隔厚度正常均一。血管腔內(nèi)未見紅細胞滲出，無灶性肺不張，僅有少量粒細胞浸潤。LPS模型組HE染色可見肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)炎性細胞浸潤，肺間質(zhì)增寬，肺間質(zhì)滲液明顯，毛細血管內(nèi)淤血。光鏡下肺組織病理評分LPS組(9.42±0.72)明顯高于正常對照組(0.70±0

8、.52)(P<0.01)。
　　2 ATⅡ的分離、純化和鑒定：通過電鏡和AKP染色鑒定大鼠ATⅡ。電鏡下觀察正常大鼠ATⅡ，可見其形狀規(guī)則，呈立方形或圓形，表面可見長短不一的微絨毛，胞質(zhì)內(nèi)可見板層小體等特征性結(jié)構(gòu)。LPS組純化后可獲得(1.35±0.04)×107個細胞。經(jīng)臺盼藍染色后LPS組細胞活力達(83±2.32)％。
　　3 ELISA結(jié)果：LPS組細胞培養(yǎng)液中IL-1β的水平(33.33±2.48)明顯高于正常組(

9、14.68±0.95)(P<0.01)
　　4 Western blotting結(jié)果：TMEM16A蛋白表達水平正常組(1.01±0.10)與LPS組(1.00±0.07)之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　結(jié)論：1通過靜脈注射LPS可以造成大鼠的急性肺損傷，本實驗成功復(fù)制了ALI模型。
　　2適當(dāng)?shù)南笣舛?、時間對于ATⅡ的分離至關(guān)重要。用IgG免疫粘附法可以提高ATⅡ的純度。電鏡下可以觀察到ATⅡ的典型結(jié)構(gòu)板