cAMP-PKA信號通路在樹突狀細胞影響調節(jié)性T細胞穩(wěn)態(tài)方面的作用.pdf

1、樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)是宿主機體先天免疫系統(tǒng)中的一員，它是一種高效的抗原提呈細胞，可感知和捕獲外界刺激，決定宿主是否啟動免疫防御以及啟動何種免疫防御，DC對機體免疫反應的調節(jié)可通過一定的信號通路。調節(jié)性T細胞(Regulatory T cell，Treg)是一種免疫抑制細胞，在平衡免疫反應和免疫耐受中發(fā)揮關鍵作用，其穩(wěn)態(tài)可以受到DC的調節(jié)。但具體通過怎樣的分子途徑仍然未知。
　　本研究利用PKA調節(jié)亞單位

2、R1αf/f小鼠模型和Cbl-b-/-C-cblf/f小鼠模型，構建了R1α和Cbl-b/C-cbl在DC細胞中條件性敲除小鼠，結果證實，DC中cAMP/PKA信號通路和Cbl信號通路均在其調節(jié)Treg穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用，并在此基礎上深入研究cAMP/PKA信號通路在DC中的作用，及其調節(jié)Treg穩(wěn)態(tài)的機制。
　　1 cAMP/PKA和Cbl信號通路均參與樹突狀細胞對調節(jié)性T細胞穩(wěn)態(tài)的影響
　　為研究DC影響Treg穩(wěn)態(tài)可以通過

3、哪條信號通路，我們利用實驗室現(xiàn)有R1αf/f小鼠模型和Cbl-b-/-C-cb1f/f小鼠模型，構建了他們在DC細胞中的敲除小鼠。DC敲除R1α，PKA中R亞單位失去了對C亞單位的抑制，從而模擬了cAMP/PKA信號通路的激活。敲除小鼠的DC在淋巴結和脾臟中均出現(xiàn)顯著性增殖，脾臟的DC甚至出現(xiàn)了一群特殊的MHCⅡhiCD11clow DC，由于跟淋巴結中遷移DC相似，我們稱之為S2DC。
　　DC中敲除Cbl-b/C-cbl，盡管

4、敲除小鼠脾臟中cDC的比例和數(shù)量沒有變化。但CD8+DC和CD11b+DC的比例卻發(fā)生了逆轉:WT小鼠CD8+DC&CD11b+DC比例大約為2:7;而cbl-b-/-C-cblDCKO小鼠的比例則正好相反，幾乎為7∶2。更重要的是，這兩種敲除小鼠淋巴器官中的Treg均出現(xiàn)顯著性增殖。這說明cAMP/PKA信號通路和Cbl信號通路在DC細胞在調節(jié)Treg的穩(wěn)態(tài)中均發(fā)揮一定作用。
　　2 cAMP/PKA信號通路在樹突狀細胞中激活對

5、其自身發(fā)育和功能的影響
　　病原菌的感染與宿主免疫密不可分。我們以R1αDCKO小鼠為工具，著重研究了cAMP/PKA信號通路在DC調節(jié)Treg穩(wěn)態(tài)中的機制。在病原引起宿主免疫防御的研究中具有一定意義。上一章的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，小鼠的DC細胞中cAMP/PKA信號通路激活，會導致DC細胞在淋巴器官內聚集，與此同時，敲除小鼠的Treg也在淋巴器官內出現(xiàn)了廣泛性增殖。這說明cAMP/PKA信號通路在DC細胞調節(jié)Treg的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮一定作用

6、。本章旨在研究cAMP/PKA信號通路在DC中激活對其本身發(fā)育和功能的影響。由于R1αDCKO小鼠淋巴器官中的DC增殖，而淋巴器官中DC的來源可能有2種，一是在骨髓發(fā)育中產生，通過血液循環(huán)到達淋巴器官;二是外周非淋巴器官的DC通過淋巴管道遷移至淋巴器官。我們首先發(fā)現(xiàn)，骨髓中DC的前體細胞preDC在WT和R1αDCKO小鼠中無顯著性差別。另外，體外FLT-3L培養(yǎng)DC在WT和R1αDCKO小鼠中也無顯著性差別，這說明DC增殖的原因并不是

7、因為其在發(fā)育過程中生成的更多。
　　外周非淋巴組織中的DC在收到諸如炎癥等“危險信號”后，會向淋巴器官移動。在這個過程中，DC成熟，趨化因子受體CCR7的表達量會升高。這說明CCR7在DC遷移功能中具有關鍵性作用。經(jīng)流式細胞檢測，R1αDCKO小鼠皮膚cDC比例下降至WT小鼠的1/3，同時，皮膚和脾臟中CCR7的表達量都顯著性高于WT小鼠。提示cAMP/PKA信號通路激活可能模擬了DC受到“危險信號”，因此上調CCR7的表達，從而

8、使得大量的外周非淋巴組織中DC遷移至淋巴器官，并聚集于此，脾臟甚至形成S2DC。
　　3 R1α基因敲除小鼠的樹突狀細胞可通過cAMP/PKA信號通路影響調節(jié)性T細胞的穩(wěn)態(tài)
　　上一章已經(jīng)證實DC中活化cAMP/PKA信號通路，可上調趨化因子受體CCR7的表達使得外周非淋巴組織的DC大量向淋巴器官聚集。本章旨在研究DC是如何影響Treg增殖的，是直接調節(jié)還是間接調節(jié)？以及這個調節(jié)與信號通路cAMP/PKA之間的關系。我們首先

9、觀察到R1αDCKO小鼠具有高水平的IL-2的生成。而IL-2是Treg產生和增殖所需最重要的一種細胞因子。體內封閉IL-2的產生可以使R1αDCKO小鼠脾臟中增殖的Treg出現(xiàn)下降。這說明R1αDCKO小鼠脾臟中增殖的Treg依賴IL-2的產生。進一步研究發(fā)現(xiàn)R1αDCKO小鼠中過量的IL-2是由于CD4+T細胞產生過多引起的。而CD4+T細胞產生IL-2是由于受到了抗原的刺激。體外抗原提呈實驗證實，R1αDCKO小鼠的S2DC具有更

10、強的抗原提呈能力，從而刺激了相應的OTⅡ CD4+T細胞分泌更多的IL-2。這是因為R1αDCKO小鼠的S2DC表達更高的MHCⅡ水平。MHCⅡ是DC提呈抗原給CD4+T細胞的必要分子結構。體外封閉S2DC的MHCⅡ表達可以抑制S2DC的抗原提呈能力，并抑制IL-2的產生。
　　綜上所述，DC中cAMP/PKA信號通路激活，如同受到“危險信號”指令，因此上調CCR7的表達，使外周非淋巴組織DC向淋巴器官遷移，使脾臟聚集了一群MHC

11、ⅡhiDC，這群DC有更強的抗原提呈能力，能夠刺激CD4+T細胞產生更多的IL-2，引起Treg穩(wěn)態(tài)失調，表現(xiàn)為大量的增殖。
　　4生理狀態(tài)下的樹突狀細胞可通過cAMP/PKA信號通路影響調節(jié)性T細胞的穩(wěn)態(tài)
　　DC除了在受到外界病原菌感染過程中可通過cAMP/PKA信號通路影響Treg穩(wěn)態(tài)，在正常生理狀態(tài)下也可以通過cAMP/PKA信號通路調節(jié)Treg。紫外線照射是一種正常的生理現(xiàn)象。它作為一種普遍的外環(huán)境刺激可影響抗原提

12、呈細胞的功能。DC則是皮膚上最主要的抗原提呈細胞。研究證實，紫外線照射會影響皮膚DC在皮膚上的分布，從而影響下游的免疫反應，誘導活化Treg。這說明DC是可以影響Treg穩(wěn)態(tài)的。本課題通過紫外線照射小鼠模型，成功模擬出了DC遷移和Treg的增殖。有意思的是，紫外線照射引起DC的遷移是即刻發(fā)生的，而引起Treg的增殖則是需要時間的累積，這提示Treg的增殖可能是受DC遷移的影響而繼發(fā)產生的。與此同時，體內適應性轉移的Treg也可以在紫外線

13、照射的小鼠模型中出現(xiàn)增殖，這說明DC是可以直接影響Treg穩(wěn)態(tài)的。盡管DC可調節(jié)Treg近年來已被多種實驗證實，然而具體調節(jié)的機制仍不清楚。機體感知外界信號需要通過一定的信號轉導通路。經(jīng)研究證實，紫外線照射皮膚，可刺激機體產生大量的前列腺素E2(pGE2)。pGE2是通過結合其在細胞膜上的G蛋白耦連受體EP傳遞信號刺激。而EP又在cAMP/PKA途徑的上游，這提示紫外線照射產生pGE2是通過cAMP/PKA途徑。
　　為研究紫外線

14、照射引起皮膚DC遷移，引流淋巴結Treg增殖是通過cAMP/PKA途徑。我們在實驗室建立的紫外線照射小鼠模型中封閉了小鼠體內pGE2的產生，發(fā)現(xiàn)受到紫外線照射增殖的Treg在封閉了pGE2后得到了部分下降，這就第一次證明紫外線照射引起DC遷移和Treg的增殖是可以部分通過cAMP/PKA途徑。
　　5（國內研究部分）豬鏈球菌2型轉錄調控因子Tran功能的研究
　　豬鏈球菌2型是一種重要的人畜共患病病原。豬鏈球菌病的爆發(fā)不但給

15、養(yǎng)豬產業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，還可感染人類具有重要的公共衛(wèi)生學研究意義。本課題以我國豬群中廣泛流行的豬鏈球菌2型(SS2)豬源ZY05719株為研究對象，前期通過抑制性差減雜交鑒定出可能與SS2毒力相關的新型轉錄調控因子Tran，通過構建敲除突變株△tran，對該基因進行深入研究。結果表明與野毒株相比，敲除株生長速率緩慢，粘附能力減弱，斑馬魚毒力下降。此外，利用基因芯片的分析手段，進一步明確了tran在轉錄調控方面的功能。芯片結果分析表明

16、tran基因的敲除導致細菌全基因組中的130個基因發(fā)生差異性表達，其中上調基因21個及下調基因109個，基因功能涵蓋編碼各類蛋白酶及核酸酶，ABC轉運系統(tǒng)組分，熱休克蛋白，ATP結合蛋白，膜蛋白等多種功能基因。芯片結果已被qRT-PCR驗證。在所有發(fā)生差異性表達的基因中最主要是編碼糖代謝有關的酶類和熱休克蛋白家族，這提示Tran在調控細菌自身糖代謝和抵抗外界宿主環(huán)境應激能力方面具有重要作用。而這也被后續(xù)實驗所證實。綜上所述，tran不僅

17、僅是毒力相關因子，且作為調控基因在整體調控網(wǎng)絡層面對SS2致病力產生重要影響。
　　豬鏈球菌感染宿主，可引起宿主先天性免疫和適應性的免疫反應。盡管其中的分子機制仍不清楚，但豬鏈球菌鑒定出來許多毒力因子都與感染中和宿主的相互作用有關。莢膜多糖CPS可以抵抗宿主免疫細胞的吞噬，是最重要的毒力因子。最近研究發(fā)現(xiàn)，豬鏈球菌表面的腺苷酸合成酶Ssads也可能是一種毒力相關因子。它可將宿主細胞中的核苷酸轉化成腺苷酸。一旦腺苷酸在細胞內累計，可