福建省丙型肝炎流行特征及體外細胞培養(yǎng)模型的構建與應用.pdf

1、目的：
　　 近年疾病監(jiān)測網絡直報數(shù)據(jù)顯示，我國丙型肝炎報告病例數(shù)呈遞增態(tài)勢，而丙型肝炎感染后癥狀的隱匿性使其易發(fā)展成慢性肝炎、肝硬化甚至是肝細胞癌，丙型肝炎已經成為重大的公共衛(wèi)生問題。我國關于丙型肝炎流行病學、病原學方面的研究較少，而福建省僅在1992年進行過自然人群丙型肝炎抗體陽性率的調查，此后未見大規(guī)模的流行病學研究，也未見報道福建省丙型肝炎病毒基因型的分布特征。另外，不同基因型間對抗病毒藥物的敏感性不同，而丙型肝炎病毒體

2、外培養(yǎng)模型的缺乏使其在致病機制、疫苗研究、藥物篩選等方面的研究長期停滯不前。因此，為了更好地預防和控制丙型肝炎，非常有必要對福建省丙型肝炎的流行特征進行分析，獲取丙型肝炎流行現(xiàn)狀的基礎資料，建立丙型肝炎報告數(shù)的預測模型，為丙型肝炎防治策略的制定提供數(shù)據(jù)支持；此外，建立福建省丙型肝炎流行基因型病毒株的體外培養(yǎng)模型，為丙型肝炎基礎研究提供平臺，在此基礎上進行藥物篩查等工作，從實踐意義上指導丙型肝炎臨床用藥。
　　 方法：
　　

3、 1、采用多階段抽樣的方法，通過橫斷面調查研究，獲取丙型肝炎流行現(xiàn)狀的基礎資料；應用間接ELISA方法檢測血清中的丙型肝炎病毒抗體，分析2006年福建省自然人群抗-HCV陽性率；
　　 2、通過收集無償獻血者、吸毒者以及醫(yī)院來源的抗-HCV陽性的血清標本，采用RT-PCR方法，分別進行C/E1區(qū)和NS5B區(qū)基因的擴增、克隆和測序，應用生物學軟件對序列進行分析比較，構建序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析福建省不同人群間基因分布的特征；

4、>　　 3、根據(jù)《中國疾病預防控制信息系統(tǒng)》疫情數(shù)據(jù)庫中福建省2004～2010年HCV的月報發(fā)病數(shù)據(jù)，分析其數(shù)據(jù)特征，建立最優(yōu)的發(fā)病預測模型；
　　 4、應用長片段核酸擴增和基因克隆技術，獲取不同亞型HCV基因組的全長序列，構建重組質粒；將福建流行株全長基因與JFH1株的非編碼區(qū)進行嵌合，經體外轉錄、Huh7細胞轉染，構建不同亞型嵌合的體外細胞培養(yǎng)模型，經IFA、RT-PCR等方法對其進行驗證鑒定，并初步將該模型用于體外藥物

5、篩選。
　　 結果：
　　 1、福建省自然人群抗-HCV陽性率為0.7％，地區(qū)分布無差異，男女無差異，隨著年齡增長，抗-HCV陽性率有增加趨勢，尤其是50歲以上年齡組，抗-HCV陽性率遠高于50歲以下年齡組；雖然1992年人群抗-HCV陽性率的調查存在假陽性率等問題，結合其他資料，可以認為人群抗-HCV陽性率呈下降趨勢，但HCV防治形勢不容樂觀；
　　 2、福建省丙型肝炎主要流行基因型為6a和1b，其次為3b和2

6、a，不同人群間流行基因型有差別，臨床病例的主要流行基因型為1b，而無償獻血者和吸毒者主要流行基因型為6a，從不同人群間流行基因型分布的差異可以推論，可能存在主要流行基因型由1b向6a轉變的情況；還發(fā)現(xiàn)可能存在混合感染的情況，主要表現(xiàn)為3b亞型與其他型別的重組；
　　 3、《中國疾病預防控制信息系統(tǒng)》疾病監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，自2004年實行網絡直報后，丙型肝炎報告數(shù)呈逐年上升趨勢，且報告數(shù)的上升是由臨床診斷病例數(shù)上升引起的，實驗室確診病

7、例數(shù)基本保持穩(wěn)定，臨床診斷病例數(shù)的上升可能有幾個方面原因：責任人報告意識增強、感染者發(fā)展為病人、報告人掌握的HCV診斷標準不嚴謹；
　　 4、建立的ARIMA(2,1,0)(2,1,0)12(無常數(shù))模型對丙型肝炎月報數(shù)進行了較好的跟蹤與預測，但由于外界其他因素變化的影響，用于中短期預測效果優(yōu)于長期預測。
　　 5、擴增并拼接了6株不同亞型的丙型肝炎病毒全長基因（其中1b亞型兩株，3a、3b、6a及6n亞型各一株）以及1

8、a亞型半長片段；構建了全長重組質粒pBS1、pBR2、pBSR5、pXX4、pXX19及pXQ124；
　　 6、成功構建了pBS1/JFH1（6a/2a）嵌合體外細胞培養(yǎng)模型。pBS1/JFH1經體外轉錄產生的感染性RNA轉染Huh7細胞后產生的衍生病毒可以引起新的Huh7細胞的感染，與pJFH1相比，構建的嵌合株感染力相對較弱；
　　 7、將構建的pBS1/JFH1（6a/2a）嵌合體外細胞培養(yǎng)模型初步應用于藥物篩選

9、。研究結果表明INFα能有效抑制病毒復制，而且這種抑制呈劑量依賴性，RBV、NTZ和CsA單獨應用也都能抑制HCV病毒的復制，但需要較大劑量，而這三種藥物與INFα聯(lián)合應用，都能顯著提高INFα的抗病毒作用。
　　 結論：
　　 1、福建省自然人群抗-HCV陽性率呈現(xiàn)下降趨勢，但由于受HCV易慢性化特點的影響，使多年前HCV較高的陽性率表現(xiàn)為目前發(fā)病率的逐年增加。
　　 2、完成福建省不同人群HCV基因流行型分析