整合素β1對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)及其并發(fā)癥是威脅人類(lèi)健康的“第一殺手”。AS的發(fā)生是一個(gè)多種因素在多層次上綜合作用的過(guò)程。血脂水平的升高伴隨著單核細(xì)胞活化成為巨噬細(xì)胞以及大量氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)的生成，隨之巨噬細(xì)胞在一系列信號(hào)分子的介導(dǎo)下吞噬ox-LDL 形成泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞的形成是AS 早期變化的特征性標(biāo)志，也是AS 斑塊損傷形成、

2、發(fā)展和崩解的關(guān)鍵。因此，在廣泛使用調(diào)脂抗炎藥物防治AS的同時(shí)，抑制巨噬源性泡沫細(xì)胞的形成作為AS治療的新策略日益受到重視。
　　 我室前期對(duì)AS 發(fā)生過(guò)程中差異表達(dá)基因的研究表明，整合素家族的基因包括integrin β1、integrin β2、integrin α6等均顯著上調(diào)；對(duì)AS 過(guò)程中關(guān)鍵基因篩選、鑒定及三七總皂苷(totAlsaponins of Panax notoginseng, PNS)調(diào)控作用的研究發(fā)現(xiàn)，整

3、合素家族表達(dá)上調(diào)作用尤為明顯，對(duì)整合素家族的調(diào)控是PNS 防治AS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。整合素β1(integrin β1)在AS 發(fā)生早期主要介導(dǎo)了單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附，但是在巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL 形成泡沫細(xì)胞的過(guò)程中是否發(fā)揮作用及其相關(guān)機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。為此，本課題應(yīng)用RNA 干擾技術(shù)探討integrin β1對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響及其初步機(jī)制，為AS的防治提供新的靶標(biāo)。
　　 方法：
　　 1．檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞的轉(zhuǎn)

4、染效率：RAW264.7細(xì)胞用含10％ FBS的DMEM 培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)至30％-50％融合后，分為Cy3 標(biāo)記siRNA 轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染組用lipo2000脂質(zhì)體試劑將Cy3-siRNA 轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中，空白對(duì)照組除了不加轉(zhuǎn)染試劑和siRNA 外其他操作相同。轉(zhuǎn)染8h后，置于熒光顯微鏡下綠光(G)激發(fā)，觀察細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光表達(dá)情況。
　　 2．篩選最有效的siRNA：針對(duì)integrin β1基因的不同

5、靶點(diǎn)設(shè)計(jì)3 條siRNA。RAW264.7細(xì)胞用含10％ FBS的DMEM 培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)至30％-50％融合后，用lipo2000脂質(zhì)體試劑分別將siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNANC 轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中，另設(shè)空白對(duì)照組，不加任何轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組，只加lipo2000脂質(zhì)體試劑，不加siRNA。轉(zhuǎn)染24h后，應(yīng)用Real-time PCR 檢測(cè)integrin β1基因mRNA表達(dá)水平。
　　

6、 3．RAW264.7細(xì)胞用含10％ FBS的DMEM 培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)至30％-50％融合后分為siRNA1轉(zhuǎn)染組、siRNANC 陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組4組，各轉(zhuǎn)染組分別用lipo2000脂質(zhì)體試劑將siRNA和siRNANC 轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中，空白對(duì)照組正常培養(yǎng)，不加任何轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組只加lipo2000脂質(zhì)體試劑，不加siRNA。轉(zhuǎn)染24 h后，黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組細(xì)胞的黏附率。
　　

7、 4．RAW264.7細(xì)胞用含10％ FBS的DMEM 培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)至30％-50％融合后分為siRNA1轉(zhuǎn)染組、siRNANC 陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組4組，各組處理同前。轉(zhuǎn)染6 h后，用含ox-LDL(25 mg/L)的DMEM 培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)各組細(xì)胞18h后，脂質(zhì)化學(xué)染色法測(cè)定各組細(xì)胞的泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，膽固醇氧化酶終點(diǎn)法測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)的總膽固醇含量，原子力顯微鏡觀察各組細(xì)胞膜上的小凹結(jié)構(gòu)，western bl

8、ot 檢測(cè)各組細(xì)胞膜上清道夫受體CD36的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1．轉(zhuǎn)染效率：熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染Cy3 標(biāo)記siRNA的RAW264.7細(xì)胞中有紅色熒光表達(dá)，提示轉(zhuǎn)染試劑lipo2000能成功將siRNA 轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，且轉(zhuǎn)染效率可高達(dá)98％。
　　 2．最有效siRNA的篩選：3 條siRNA對(duì)integrin β1mRNA表達(dá)的沉默效率分別為65％、50％和58％。因此后續(xù)試驗(yàn)選用siRNA1進(jìn)行

9、。
　　 3．有效沉默RAW264.7細(xì)胞的integrin β1基因表達(dá)后，與對(duì)照組相比，其黏附功能顯著降低(P＜0.01)；ox-LDL 誘導(dǎo)培養(yǎng)后，siRNA 轉(zhuǎn)染組泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化率明顯降低(P＜0.01)，總膽固醇顯著減少(P＜0.01)；原子力顯微鏡觀察到siRNA 轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞膜上小凹結(jié)構(gòu)減少，WB 結(jié)果顯示siRNA 轉(zhuǎn)染組CD36表達(dá)降低(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.沉默integri