miR-128靶向CCL18調(diào)控黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制分析.pdf

1、皮膚惡性黑素瘤(cutaneous malignant melanoma，CMM)是一種高度惡性的皮膚腫瘤，具有侵襲性強(qiáng)、易早期發(fā)生轉(zhuǎn)移、致死率高等特點(diǎn)。黑素瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞與腫瘤浸潤微環(huán)境通過細(xì)胞因子等分子信號相互作用的結(jié)果，腫瘤浸潤微環(huán)境中的關(guān)鍵分子對腫瘤的診斷和靶向治療具有重要意義，成為腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)趨化因子CCL18在CMM組織中表達(dá)上調(diào)，并通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)CCL18具有促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的

2、作用，是黑素瘤的潛在致病基因。本研究從RNAi方面開展皮膚黑素瘤CCL18表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究，明確miR-128及CCL18在黑素瘤組織中的表達(dá)及其關(guān)系，初步探索miR-128靶向CCL18調(diào)控黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用，篩選出高效沉默CCL18的miRNA分子，為黑素瘤的治療提供新的切入點(diǎn)。
　　第一部分 CCL18在皮膚黑素瘤組織、患者血清中的表達(dá)及意義
　　本課題組前期通過全基因組表達(dá)芯片技術(shù)進(jìn)行差異表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)CC

3、L18基因在中國人肢端黑素瘤(acral lentiginous melanoma，ALM)患者的腫瘤組織中表達(dá)發(fā)生明顯上調(diào)，并通過免疫組化方法初步驗(yàn)證CCL18在CMM中的表達(dá)高于色素痣，而且CCL18水平在Clark分級≥Ⅱ級的黑素瘤明顯高于Clark分級Ⅰ級的黑素瘤。為探討趨化因子CCL18表達(dá)與皮膚黑素瘤的發(fā)生發(fā)展過程的關(guān)系，通過real-time PCR、ELISA分析，發(fā)現(xiàn)CMM患者組織中CCL18mRNA及血清中CCL18

4、蛋白水平明顯增高。此外擴(kuò)大樣本量通過免疫組化方法檢測CCL18在58例CMM及50例色素痣中的表達(dá)，并分析CCL18表達(dá)水平與黑素瘤臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果證實(shí)CCL18在CMM中表達(dá)增加，其表達(dá)水平與腫瘤Clark分級、Breslow厚度及VEGF表達(dá)呈正相關(guān)性，并且CCL18在腫瘤發(fā)生潰瘍及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況時(shí)表達(dá)水平較高?？梢奀CL18在CMM組織中呈異常高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與CMM惡性程度密切相關(guān)。此外，免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)皮膚惡性黑

5、素瘤組織中腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)CCL18。
　　第二部分 靶向調(diào)控CCL18基因的miRNAs生物信息學(xué)預(yù)測及篩選
　　通過生物信息學(xué)分析預(yù)測靶向調(diào)控CCL18的miRNAs，并應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因檢測法對預(yù)測的miRNAs與CCL18基因3'UTR的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證。采用real-time PCR法檢測14例CMM新鮮組織中CCL18和預(yù)測的miRNAs的表達(dá)，并分析相關(guān)性，其中miR-128在CMM中表達(dá)降低，而且與CCL1

6、8的表達(dá)具有顯著負(fù)相關(guān)性。結(jié)果表明miR-128可能是靶向沉默CCL18基因的miRNA分子。
　　第三部分 靶向沉默CCL18基因的miR-128調(diào)控效應(yīng)分析
　　前文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-128可能是靶向調(diào)控CCL18基因的miRNA分子，將miR-128作為研究對象。通過RNAi研究miR-128對CCL18表達(dá)的調(diào)控，以及miR-128調(diào)控CCL18對人黑素瘤細(xì)胞株A375生物學(xué)行為的影響及其可能機(jī)制。CCL18在黑素

7、瘤細(xì)胞株A375、M14、MV3和SK-mel-28中均不表達(dá)，IL-4(20ng/ml)刺激人外周血單核細(xì)胞可產(chǎn)生CCL18。因此采用單核細(xì)胞與A375細(xì)胞株共培養(yǎng)的方法模擬腫瘤浸潤微環(huán)境，采用攜帶miR-128mimics的腺病毒轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞，同時(shí)用陰性對照腺病毒設(shè)置對照。采用CCK8法檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞集落形成能力，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞運(yùn)動遷移能力，觀察各組A375細(xì)胞的

8、體外生物學(xué)行為改變;進(jìn)一步通過Western blot方法檢測細(xì)胞中E-cadherin，N-cadherin及β-catenin表達(dá)情況。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-128mimics顯著降低單核細(xì)胞CCL18的表達(dá)，能夠有效促進(jìn)人黑素瘤細(xì)胞株A375凋亡，抑制細(xì)胞跨膜遷移及克隆形成，但對細(xì)胞增殖無影響。黑素瘤細(xì)胞中間質(zhì)型蛋白N-cadherin表達(dá)降低。miR-128沉默CCL18可能抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

9、>　　結(jié)論:
　　在惡性黑素瘤組織及患者血清中，趨化因子CCL18表達(dá)均明顯上調(diào)，且高表達(dá)與黑素瘤的惡性程度相關(guān)。miR-128能夠作用于CCL18基因的3'UTR發(fā)揮靶向沉默作用。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明miR-128靶向沉默CCL18表達(dá)可促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞A375調(diào)亡，明顯降低其克隆形成及遷移運(yùn)動能力，影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而部分抑制CCL18的促癌作用。可見，趨化因子CCL18與惡性黑素瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，CCL18在促進(jìn)黑素瘤的侵