miR-128通過靶向Galectin-3抑制結腸癌細胞的抗藥性及侵襲轉移能力.pdf

1、研究背景與目的：
　　結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）的死亡率居全球惡性腫瘤的第4位，其發(fā)病率和死亡率近年在我國有持續(xù)升高的趨勢。CRC的侵襲轉移和化療不敏感是影響治療效果和生存預后的重要制約因素。因此，闡明CRC侵襲轉移機制并尋找新而有效的治療靶標以抑制其侵襲轉移及增加化療敏感性是提高CRC臨床療效和降低死亡率的關鍵所在。
　　β半乳糖苷凝集素-3（Galectin-3）被稱為腫瘤相關蛋白，研究表明，

2、Galectin-3一方面參與調節(jié)腫瘤細胞的生長、凋亡、黏附、血管生成，另一方面還介導腫瘤侵襲和轉移，但其調節(jié)機制尚不清楚。本課題將進一步明確Galectin-3在CRC侵襲轉移及化療反應中的作用，并初步探討Galectin-3在CRC中的表達調控機制。
　　研究方法：
　?。?）采用Western blot和免疫組化方法分別檢測Galectin-3在結直腸癌細胞及結直腸癌組織中的蛋白表達情況。
　?。?）構建Gale

3、ctin-3的過表達載體及空白對照載體，用脂質體法轉染Hela細胞。實時熒光定量PCR及Western blot驗證轉染效果。分別應用Transwell細胞侵襲實驗和MTS實驗檢測Galectin-3過表達前后侵襲能力和藥物敏感性變化。
　?。?）利用生物信息學在線預測軟件分析篩選出可能靶向調控 Galectin-3表達的miR-128。利用qRT-PCR的方法檢測了所有結腸癌細胞及Hela細胞miR-128的表達，篩選出 miR

4、-128表達水平最低的結直腸癌細胞 SW620、HT-29作為后續(xù)實驗的細胞模型。將has-miR128-3p minics分別轉染結直腸癌細胞SW620、HT-29后，采用實時熒光定量PCR及Western blot檢測細胞中Galectin-3的表達情況。利用Transwell細胞侵襲實驗和MTS法分別檢測miR-128轉染組及對照組的侵襲能力及藥物敏感性變化。將miR-128和重組有Galectin-3基因3’-UTR區(qū)miR-1

5、28潛在結合位點的野生型和突變型的熒光素酶報告基因分別共轉染293T細胞，24小時后檢測熒光素酶活性，進一步驗證miR-128對Galectin-3的直接靶向調控作用。
　　（4）在已轉染miR-128的SW620和HT-29細胞中過表達Galectin-3，Western blot、qPCR檢測Galectin-3的表達，Transwell細胞侵襲實驗及MTS檢測結腸癌細胞的生物學行為變化。
　　結果：
　?。?）W

6、estern blot結果顯示：10株結直腸細胞中（Caco2、HT-29、HCT8、HCT116、SW480、SW620、LOVO、RKO、LS174T、DLD1）均普遍高表達 Galectin-3。免疫組化顯示：Galectin-3在結腸癌組織中主要定位于細胞的胞漿及胞核，其陽性表達率為86.4％，在正常組織中陽性表達率為22.0%，兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Galectin-3的表達水平與是否存在淋巴結轉移、TN

7、M分期有關（P＜0.05）；而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大直徑、分化程度、術前CEA水平無關（P＞0.05）。
　?。?）在Galectin-3表達豐度較低的Hela細胞中過表達Galectin-3后，Transwell細胞侵襲實驗檢測結果顯示：轉染空白質粒組 Hela細胞遷移至下室的細胞數(shù)目為（86.33±4.910）個，過表達 Galectin-3的 Hela細胞遷移至下室的細胞數(shù)目為（213.0±4.933）個，兩者比較

8、差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。使用順鉑、奧沙利鉑、5-Fu和紫杉醇處理分別轉染空白質粒和Galectin-3過表達后的Hela細胞，MTS檢測細胞活性結果提示：過表達Galectin-3的Hela細胞對順鉑、奧沙利鉑、5-Fu和紫杉醇的藥物敏感性明顯降低，與同等藥物濃度處理的轉染空白質粒組的 Hela細胞活性相比，差異具有顯著性（P＜0.05）。結果提示過表達Galectin-3的Hela細胞的侵襲轉移能力及抗藥性均明顯增加。

9、r>　?。?）通過生物信息學在線預測軟件分析，發(fā)現(xiàn) miR-128可能靶向調控 Galectin-3的表達。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)在10株結腸癌細胞中miR-128的表達均明顯低于Galectin-3低表達的Hela細胞（P＜0.05），提示miR-128的表達模式與Galectin-3表達模式呈負相關。初步提示兩者之間可能存在負調控關系。使用miR-128特異性的minics轉染miR-128低表達的HT-29和SW620細胞，Wes

10、tern blot和qRT-PCR檢測兩組細胞轉染前后Galectin-3的表達，發(fā)現(xiàn)在HT-29和SW620細胞中，轉染miR-128特異性的minics后，mRNA水平和蛋白水平Galectin-3的表達均顯著低于陰性對照組，兩者相比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示miR-128的表達上調可以引起Galectin-3的表達下調。進一步采用雙熒光素酶報告基因實驗，結果也證實miR-128可以通過與Galectin-3基因3

11、’-UTR區(qū)miR-128預測結合位點相結合，從而直接負向調控Galectin-3的表達。
　?。?）在結腸癌細胞HT-29和SW620中通過轉染miR-128特異性minics恢復其中miR-128的表達水平。Transwell細胞侵襲實驗檢測結果發(fā)現(xiàn)：轉染陰性對照的HT-29和SW620細胞遷移至下室的細胞數(shù)目分別為（41.33±0.8819）個和（107.3±2.028）個，轉染miR-128 minics后HT-29和SW

12、620細胞遷移至下室的細胞數(shù)目分別為（7.333±0.8819）和（28.33±0.8819），明顯少于陰性對照組，兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示 miR-128高表達可以顯著抑制結腸癌細胞的侵襲能力。繼而使用不同濃度的順鉑、奧沙利鉑、5-Fu和紫杉醇分別處理轉染了陰性對照和miR-128 minics的HT-29和SW620細胞，結果提示：相同濃度的化療藥物處理下，轉染miR-128 minics的HT-29和SW6

13、20細胞的活性顯著低于陰性對照組，差異具有顯著性（P＜0.05），提示 miR-128過表達可以增強結腸癌細胞對藥物的敏感性。
　?。?）在結腸癌細胞HT-29和SW620中，轉染miR-128 minics引起Galectin-3低表達后，再分別轉染空白載體pLEX/MCS和Galectin-3過表達載體pLEX/Gal-3，同樣重復 Transwell細胞侵襲實驗及藥敏實驗，結果發(fā)現(xiàn)：轉染空白載體pLEX/MCS的HT-29和

14、SW620細胞遷移至下室的細胞數(shù)目分別為（8.667±0.8819）個和（41.33±2.028）個，而這一數(shù)據(jù)在轉染pLEX/Gal-3的HT29和SW620細胞中分別為（123.0±1.732）個和（180.7±1.764）個，前者明顯低于后者，兩者比較差異具有顯著性（P＜0.05）。藥敏實驗發(fā)現(xiàn)：相同濃度的化療藥物處理分別轉染pLEX/MCS和pLEX/Gal-3的HT-29和SW620細胞，轉染pLEX/Gal-3的HT-29和

15、SW620細胞的活性明顯高于轉染空白載體pLEX/MCS的HT-29和SW620細胞，兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這一結果再次證實 miR-128是通過直接靶向調控Galectin-3的表達發(fā)揮抑制結腸癌細胞侵襲轉移以及增強其對化療藥物敏感性的作用的。
　　結論：
　?。?） Galectin-3在結腸癌細胞和結直腸癌組織中普遍高表達；在結直腸癌患者中，其高表達與患者存在淋巴結轉移及臨床分期密切相關。