應用mRNA差異顯示技術篩選豬前脂肪細胞分化相關的基因.pdf

1、脂肪組織的生長與脂肪細胞體積增大及前脂肪細胞分化成脂肪細胞有關。在前脂肪細胞分化過程中伴隨著許多基因的特異性表達,細胞形態(tài)亦有相應的變化。豬是脂肪沉積能力很強的動物之一,脂肪在皮下組織和內臟器官的過度沉積是影響豬肉品質的重要因素。本研究采用mRNA差異顯示技術篩選豬前脂肪細胞分化過程相關的差異表達基因,為進一步研究豬脂肪沉積代謝的調控機制提供科學依據。
　　 試驗1、豬前脂肪細胞的分離與鑒定。
　　 取3日齡健康仔豬頸部

2、皮下脂肪組織,利用膠原酶消化法分離豬前脂肪細胞,進行原代培養(yǎng),并采用MTT法、油紅O染色、LPL活性測定來鑒定豬前脂肪細胞。結果顯示,體外培養(yǎng)的豬前脂肪細胞在經歷短暫的遲緩期后,進入對數(shù)生長期,直至第7天開始進入平臺期,在培養(yǎng)第10天開始出現(xiàn)細胞調亡。細胞形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn),原代培養(yǎng)的豬前脂肪細胞從第3天開始充脂,細胞內脂肪滴被油紅O染成紅色,此后伴隨細胞增殖和分化,充脂細胞逐漸增多,小脂滴不斷匯聚形成大脂滴,細胞也由梭形逐漸變圓,體積增大

3、。同時,LPL活性也呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。上述結果證實豬前脂肪細胞已被成功分離。
　　 試驗2、豬前脂肪細胞分化過程差異表達基因的篩選
　　 為進一步探討豬前脂肪細胞分化過程中可能表達的調控基因,采用mRNA差異顯示技術來篩選與其分化有關的差異表達基因。分別收集原代培養(yǎng)3天、5天、7天、10天的豬前脂肪細胞,用Trizol試劑提取細胞總RNA。通過RT-PCR和6％聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染顯色后,回收差異條帶,并用

4、PCR擴增,擴增片段克隆至pMD18-T載體中,測定其核苷酸序列,并將測序結果與Genbank中相關基因序列進行同源性比較。結果表明:
　　 (1)采用DDRT-PCR技術成功獲得20條EST序列,Blast在線分析結果表明,其中A22、A23、A33、A43、A55、A73、B42、C44等8個ESTs序列與Genbank數(shù)據庫已報告的基因具有高度的同源性；A21、A32、A45、B41等4個ESTs序列與Genbank數(shù)據庫

5、已報告的基因同源性較低,其功能尚不明確；A31、A53、A24、B31、B71、C21、C62、C81等8個基因ESTs序列為本研究首次發(fā)現(xiàn)。
　　 (2)A21、A23、A31、A32、A43、A53、B31、B71、C21、C62均表達于豬前脂肪細胞原代培養(yǎng)的第3天和第5天,可能與前脂肪細胞增殖有關；A22在前脂肪細胞培養(yǎng)的第3、5、7天表達,在第10天沒有表達或者是表達量很低,推測A22的表達與前脂肪細胞增殖、分化的轉換和