差異基因表達譜分析并檢測小鼠燒傷早期免疫相關基因靶標的表達.pdf

1、研究背景：
　　嚴重燒傷將引起機體免疫功能的紊亂，而后者則被認為是導致燒傷患者發(fā)生多種難以控制的并發(fā)癥如多器官功能障礙綜合征(MODS)、全身炎癥反應綜合癥（SIRS）的重要因素之一。現(xiàn)階段針對燒傷后免疫功能變化的研究多是對免疫細胞及免疫因子的作用機制入手，亦或者從感染是器官功能損害方面出發(fā)，并無對燒傷后基因轉錄水平變化進行深入的研究與分析。而對基因芯片數(shù)據(jù)的分析以及生物信息學技術的應用能幫助尋找出在燒傷早期潛在的診斷及治療的靶標

2、。
　　本課題組在前期選取并研究分析了GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫中小鼠燒傷后早期白細胞基因芯片的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)燒傷后小鼠白細胞表現(xiàn)為多種生物學過程的紊亂，其中免疫系統(tǒng)過程、刺激反應等生物學過程貫穿整個燒傷早期，有研究顯示Myd88、Stat3、Stat1、Jun等基因在燒傷早期刺激反應過程中起著重要的作用。為從分子水平了解燒傷后免疫相關基因的表達情況的變化，并篩選出在其中占據(jù)重要位置的差異基因靶標，

3、本實驗利用生物信息學方法對小鼠燒傷早期免疫細胞差異基因表達譜進行分析并構建蛋白互作網(wǎng)絡，篩選在燒傷后免疫系統(tǒng)功能變化過程中起到重要作用的潛在生物學靶標，利用實時熒光PCR及Western blotting對所篩選的基因表達變化情況進行驗證，以期從分子水平了解燒傷后免疫功能變化情況，為臨床上燒傷早期診斷及治療靶點的篩選提供新方向。
　　研究目的：
　　利用生物信息學方法對小鼠燒傷早期免疫細胞差異基因表達譜進行分析，篩選相關差異

4、基因，并對所篩選的基因表達情況進行驗證，以期找到潛在的診斷及治療靶標。
　　研究方法：
　　1.基因芯片數(shù)據(jù)處理及分析
　　從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE7404數(shù)據(jù)集。對燒傷后1天的樣本進行分析，共8個樣本（小鼠，25％TBSAⅢ°燒傷，全血游離白細胞），其中4個為燒傷組，4個為對照組。
　　2.差異表達基因的獲取
　　差異基因的獲取及統(tǒng)計分析采用開源統(tǒng)計軟件R3.02版本(http://www.r-

5、project.org)進行。采用RMA(robust multiarray average)對原始數(shù)據(jù)進行背景矯正，配對樣本t檢驗和倍比法(fold change，F(xiàn)C)獲取差異表達基因。
　　3.功能富集分析及免疫相關差異基因蛋白互作網(wǎng)絡的構建與分析
　　將差異基因經(jīng)DAVID進行ID轉換后輸入到STRING9.1數(shù)據(jù)庫中，選取中等可信度（交互作用評分大于0.4）的互作關系構建免疫相關差異表達基因的蛋白互作網(wǎng)絡（Prot

6、ein-protein interaction network，PPI），并對差異基因進行GeneOntology(GO)功能富集分析，網(wǎng)絡分析及MCL子網(wǎng)絡聚類分析采用生物圖表可視化工具Cytoscape軟件進行。
　　4.免疫相關基因靶標表達的檢測
　　選取32只健康成年BALB/c小鼠，體重20-22g，雌雄不限。隨機分為兩組，第一組為假燙傷組（sham組）、37度溫水。第二組為燙傷后1d組，小鼠用1％的戊巴比妥鈉（5

7、0mg/kg）腹腔麻醉后，背部備皮，將背部脫毛區(qū)域置于97℃熱水中燙傷15秒（建立三度燒傷模型），燙傷后立即腹腔注射生理鹽水抗休克處理。各組小鼠按分組的時間點行眼部取血，提取血液中的白細胞，然后提取mRNA及蛋白，實時熒光PCR及Western blotting檢測小鼠燒傷后白細胞中LCK、CDK1、JUN、CD19和STAT1的相對表達情況。
　　5.統(tǒng)計分析:
　　采用開源統(tǒng)計軟件R3.02版本及SPSS19.0統(tǒng)計軟件

8、進行數(shù)據(jù)分析。原始數(shù)據(jù)進行RMA背景矯正，采用配對樣本t檢驗和倍比法獲取差異表達基因，同時滿足p-value＜0.01以及|logFC|＞1，且表達量變化為2倍者為差異基因。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。
　　研究結果：
　　1.基因芯片分析結果
　　共有1825個差異基因，其中上調(diào)基因658個，下調(diào)基因1167個。
　　2.差異表達基因蛋白互作網(wǎng)絡的構建與分析
　　將差異基因構建蛋白互作網(wǎng)

9、絡，該網(wǎng)絡共有1211個節(jié)點，5176條邊組成。在蛋白互作網(wǎng)絡中位于中心位置的蛋白具有最大的互作關系，并且在疾病的進展過程中可能發(fā)揮重要的作用。在蛋白互作網(wǎng)絡中，STAT1，JUN，LCK，CD40，STAT3，CD19，CD86，CDKn1a，CDK1以及Ptpn6基因具有最大互作關系。運用BinGo篩選PPI網(wǎng)絡中關聯(lián)緊密的模塊，發(fā)現(xiàn)LCK、CDK1、JUN、CD19和STAT1這5個基因在相應的子網(wǎng)絡中占據(jù)中心位置，并且在燒傷后早

10、期免疫過程發(fā)揮重要作用。
　　3.檢測小鼠燒傷早期免疫相關基因靶標的表達
　　Jun和Cdk1燒傷后第1天mRNA表達量較sham組增加(P＜0.05)，其蛋白表達量較sham組明顯增加（P＜0.01）;Stat1燒傷后第1天mRNA表達量較sham組下降（P＜0.05），蛋白表達量較sham組明顯下降(P＜0.01)，這與芯片數(shù)據(jù)分析結果相一致。但LCK及CD19燒傷后第1天的表達量較sham組增加，與蛋白互作網(wǎng)絡分析結果

11、不一致，且與sham組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　研究結論：
　　1.小鼠燒傷后細胞存在免疫系統(tǒng)過程、應對刺激反應等方面的紊亂。
　　2.在免疫相關基因的蛋白互作網(wǎng)絡中，STAT1，JUN，LCK，CD40，STAT3，CD19，CD86，CDKn1a，CDK1以及Ptpn6基因具有最大互作關系。而LCK、CDK1、JUN、CD19和STAT1這5個基因在相應的子網(wǎng)絡中占據(jù)中心位置，可能在燒傷早期免疫系統(tǒng)功能變