老年人頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊差異表達(dá)譜分析及差異基因驗(yàn)證研究.pdf

1、背景：
　　在全球范圍內(nèi)，心血管疾病是危害人類(lèi)健康的主要疾病。在致殘致死的心血管疾病中，75％以上是由動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)引起，故As是心腦血管疾病發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。目前普遍認(rèn)為As是一種慢性、進(jìn)展性、炎癥性疾病，而明確As的發(fā)病機(jī)制是防治心腦血管病的根本措施。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成是一個(gè)復(fù)雜而漫長(zhǎng)的過(guò)程，目前認(rèn)為該病理過(guò)程由多種因子參與，而炎癥反應(yīng)貫穿動(dòng)脈硬化發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程。在大量的細(xì)胞因子作

2、用下，內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷，內(nèi)皮細(xì)胞通透性下降，單核細(xì)胞穿透內(nèi)皮層進(jìn)入內(nèi)皮下形成巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞在血管內(nèi)膜吞噬脂滴形成泡沫細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞大量增殖并合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)，形成了一個(gè)由脂紋、纖維斑塊、粥樣斑塊到斑塊破裂的復(fù)合病變過(guò)程。
　　臨床病例觀察發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈狹窄的程度與急性心腦血管事件如急性冠狀動(dòng)脈綜合征、急性缺血性腦卒中等發(fā)生并不成平行關(guān)。越來(lái)越多的研究表明，急性心腦血管事件的發(fā)生不僅取決于動(dòng)脈管腔的狹窄程度，更重要的決定因素是

3、動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的形成。不穩(wěn)定斑塊即出現(xiàn)破裂的斑塊，又稱(chēng)易損斑塊，其病理特征主要為膠原含量減少，平滑肌細(xì)胞減少，炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，較薄的偏心性纖維帽，較大脂質(zhì)核心，斑塊表面裂隙，斑塊內(nèi)出現(xiàn)新生血管，斑塊內(nèi)出血、鈣化等。不穩(wěn)定斑塊引起的斑塊破裂、血栓形成和血管腔阻塞是引起急性心腦血管事件的主因。明確不穩(wěn)定斑塊的發(fā)生機(jī)制對(duì)于預(yù)防急性心腦血管事件的發(fā)生具有十分重要的理論和臨床意義。目前，不穩(wěn)定斑塊形成的病理生理學(xué)機(jī)制主要包括斑塊內(nèi)炎癥反

4、應(yīng)的增加、新生血管形成和細(xì)胞大量凋亡，而誘導(dǎo)這些過(guò)程改變的分子機(jī)制并不完全清楚。
　　基因表達(dá)芯片技術(shù)可同時(shí)比較成千上萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)變化，全面篩選某一表型或某一疾病的所有相關(guān)基因，還可揭示不同基因表達(dá)變化之間的相互關(guān)系，從而為研究基因與基因之間的內(nèi)在聯(lián)系提供線索。基因表達(dá)譜分析技術(shù)應(yīng)用到動(dòng)脈粥樣硬化領(lǐng)域已有14年的歷史。在這期間，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者基于芯片研究識(shí)別了許多動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中相關(guān)的重要基因和通路，對(duì)深入理解和全面認(rèn)

5、識(shí)該疾病做出了巨大的貢獻(xiàn)?；虮磉_(dá)譜分析可以為動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制研究提供一種全新的研究模式，為基礎(chǔ)研究提供潛在的思路和方向。目前雖然有較多的動(dòng)脈粥樣硬化基因表達(dá)譜分析研究，但大多數(shù)研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析方面存在一定的問(wèn)題。首先，樣本選取不規(guī)范如不同來(lái)源和不同部位血管組織間分析比較會(huì)引入較多的混雜因素，影響分析結(jié)果的可信度;第二，樣本量過(guò)少，可能會(huì)影響到結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。第三，動(dòng)物模型與人的物種間差異可能會(huì)影響一些研究成果在臨床中的推

6、廣應(yīng)用，如適合動(dòng)物的治療靶點(diǎn)未必在人體試驗(yàn)中有效。第四，芯片數(shù)據(jù)分析過(guò)于簡(jiǎn)單，沒(méi)有使用系統(tǒng)生物信息學(xué)分析，可能會(huì)遺漏芯片中的重要生物信息。所以，較大樣本規(guī)模的、相同來(lái)源的人體血管組織、同時(shí)經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析的研究仍然是十分缺乏和急需的。在本次研究中，通過(guò)ArrayExpress數(shù)據(jù)庫(kù)獲取不穩(wěn)定頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和穩(wěn)定頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊間差異表達(dá)基因譜，并運(yùn)用生物信息學(xué)方法分別在GO語(yǔ)義、KEGG通路和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中初步探索不穩(wěn)定斑

7、塊形成的分子機(jī)制，并在mRNA和蛋白水平驗(yàn)證本次研究所獲取的疾病相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因的差異程度，旨在尋找引起不穩(wěn)定斑塊發(fā)生的主要相關(guān)疾病基因和通路。這些為我們未來(lái)深入研究不穩(wěn)定斑塊發(fā)生機(jī)制、篩選心腦血管事件早期預(yù)警指標(biāo)和尋找穩(wěn)定斑塊的生化指標(biāo)和治療靶點(diǎn)提供理論指導(dǎo)。本研究共分為兩部分:1、差異基因表達(dá)譜獲取疾病相關(guān)基因及通路;2、在mRNA和蛋白水平上對(duì)疾病相關(guān)基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　目的：
　　1、獲取不穩(wěn)定斑塊差異基因表達(dá)譜、疾

8、病相關(guān)基因和通路
　　2、在人體頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊組織和穩(wěn)定斑塊組織中驗(yàn)證TYROBP、CXCR4和VCL差異程度。
　　方法：
　　1、下載基因表達(dá)譜原始數(shù)據(jù)
　　從ArrayExpress數(shù)據(jù)庫(kù)中下載E-MTAB-2055數(shù)據(jù)集的原始文件后，分別對(duì)探針?biāo)降男盘?hào)值進(jìn)行質(zhì)控、變異穩(wěn)定性分析、背景矯正、數(shù)據(jù)歸一化和基因注釋?zhuān)罱K轉(zhuǎn)化為基因水平的表達(dá)值。
　　2、獲取差異表達(dá)基因
　　應(yīng)用T檢驗(yàn)和差異倍數(shù)

9、法(fold-change，F(xiàn)C)識(shí)別不穩(wěn)定斑塊和穩(wěn)定斑塊間差異表達(dá)基因譜。
　　3、差異表達(dá)基因功能富集分析
　　通過(guò)DAVID網(wǎng)站(Database for Annotation，Visualization and IntegratedDiscovery)提交基因表達(dá)譜獲取的差異表達(dá)基因，分別進(jìn)行GO術(shù)語(yǔ)和KEGG通路富集分析。
　　4、構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)
　　從string（版本號(hào)9.1）網(wǎng)站下載人類(lèi)所有的蛋

10、白互作關(guān)系列表，獲取差異表達(dá)基因在蛋白層面的互作網(wǎng)絡(luò)，將差異表達(dá)基因構(gòu)成的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入到Cytoscape（版本號(hào)2.8.2）進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，查找疾病相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)模塊(module)及風(fēng)險(xiǎn)基因。
　　5、獲取頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊組織和穩(wěn)定斑塊組織
　　從南方醫(yī)院血管外科手術(shù)室收集頸動(dòng)脈斑塊組織，彩色多普勒超聲分辨頸動(dòng)脈斑塊性質(zhì)，選取有不穩(wěn)定斑塊特征并進(jìn)行頸動(dòng)脈環(huán)切術(shù)的患者納入本次研究，將手術(shù)切除連帶的斑塊旁組織作為對(duì)照斑塊（穩(wěn)定斑

11、塊）使用。
　　6、檢測(cè)人頸動(dòng)脈血管組織（穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊組織）中TYROBP、CXCR4和VCL在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。
　　7、檢測(cè)人頸動(dòng)脈血管組織（穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊組織）中TYROBP、CXCR4和VCL在蛋白水平的表達(dá)情況。
　　四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　1、獲取差異表達(dá)基因使用T檢驗(yàn)和FC方法。差異表達(dá)基因篩選閾值為p-value＜=0.01且|logFC|＞1。富集分析使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為超幾何檢驗(yàn)，G

12、O富集篩選閾值為FDR＜=0.01，KEGG富集篩選閾值為p-value＜=0.05。
　　2、所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，所有統(tǒng)計(jì)分析由SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，不穩(wěn)定斑塊與穩(wěn)定斑塊組織之間各個(gè)基因差異表達(dá)情況的比較采用Mann-whitney U檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、差異表達(dá)基因篩選結(jié)果
　　

13、本研究共獲取439個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因232個(gè)，下調(diào)基因207個(gè)。差異表達(dá)上調(diào)基因倍比變化最大的基因是heme oxygenase1(HMOX1，logFC=3.1)，差異表達(dá)下調(diào)基因倍比變化最大的基因是alpha-actin(ACTC1，logFC=-2.2)。
　　2、差異表達(dá)基因功能富集分析結(jié)果
　　GO富集結(jié)果顯示免疫應(yīng)答、免疫防御、炎癥應(yīng)答、細(xì)胞粘附、細(xì)胞因子等富集顯著性最高。通路富集結(jié)果顯示溶酶體通路、細(xì)

14、胞因子信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子互作通路、白細(xì)胞跨膜遷移通路、補(bǔ)體凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路、造血細(xì)胞譜系和酪氨酸代謝通路等被顯著富集。
　　3、差異表達(dá)基因構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network，PPI)分析結(jié)果
　　在PPI網(wǎng)絡(luò)中，TYROBP、CTSS、C1QB、PLEK、IGSF6、HCK、VCL、LAPTM5、CXCR4和FCER1G在蛋白互作網(wǎng)中處于網(wǎng)絡(luò)

15、中心位置，在生物網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要作用，可能與本次研究的老年人頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。按風(fēng)險(xiǎn)模塊中基因數(shù)目不少于5個(gè)的閾值標(biāo)準(zhǔn)，本次研究共獲取了四個(gè)與不穩(wěn)定斑塊相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)子模塊，TYROBP、CXCR4、VCL和APOE分別占據(jù)四個(gè)模塊中心位置，在風(fēng)險(xiǎn)子模塊中發(fā)揮關(guān)鍵結(jié)點(diǎn)作用。
　　4、與穩(wěn)定斑塊組織相比，不穩(wěn)定斑塊組織中TYROBP、CXCR4在mRNA水平表達(dá)上調(diào)，采用Mann-whitney U檢驗(yàn)顯示P＜0.05，差異

16、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;VCL在不穩(wěn)定斑塊組織中表達(dá)下調(diào)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5、與穩(wěn)定斑塊組織相比，不穩(wěn)定斑塊組織中TYROBP、 CXCR4在蛋白水平表達(dá)明顯增加;VCL在不穩(wěn)定斑塊組織中表達(dá)降低。
　　結(jié)論：
　　1、免疫和炎癥反應(yīng)在不穩(wěn)定斑塊發(fā)生中發(fā)揮重要作用;
　　2、差異基因表達(dá)譜分析顯示TYROBP和CXCR4表達(dá)下調(diào)，VCL表達(dá)上調(diào)，其可能在不穩(wěn)定斑塊形成過(guò)程中發(fā)揮作用;
　　3、在mRNA水平，C