捻轉(zhuǎn)血矛線蟲HC29、Dim-1和Lipase基因的克隆及免疫保護(hù)作用研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）屬毛圓科（Trichostrongylidae）血矛屬（Haemonchus）線蟲，是羊（山羊，綿羊）的主要胃腸道寄生蟲之一，常常導(dǎo)致羊特別是羔羊貧血、消瘦、甚至死亡，造成重大經(jīng)濟(jì)損失．對反芻獸胃腸道線蟲，尤其是對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的控制至今仍停留在化學(xué)藥物驅(qū)殺階段，但是抗藥性蟲株的產(chǎn)生已經(jīng)很大程度上影響了化藥的效力，這已經(jīng)迫使人們將注意力轉(zhuǎn)移到利用免疫學(xué)方法來防治該病，尤其是疫苗的開發(fā)

2、上．發(fā)現(xiàn)新的具有線蟲發(fā)育調(diào)節(jié)性的或強(qiáng)免疫原性的基因?qū)Πl(fā)展有效的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲疫苗是十分必要的．
　　 本文利用cDNA末端快速擴(kuò)增法（RACE）技術(shù)首次地克隆出捻轉(zhuǎn)血矛線蟲谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、肌撕裂蛋白(Dim-1)和脂肪酶（Lipase）三個(gè)新基因的全長cDNA序列，隨后對之進(jìn)行序列或重組蛋白活性的分析．根據(jù)其他研究者的報(bào)道及研究結(jié)果來看，其中GPX和Ljpase都是和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白，Dim-1是具有強(qiáng)

3、免疫原性的蛋白。最后將GPX和Dim-1構(gòu)建成DNA疫苗并對山羊免疫，評估其針對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的保護(hù)效力，且對產(chǎn)生的保護(hù)作用的免疫機(jī)理做了初步的探究。具體工作如下：1．捻轉(zhuǎn)血矛線蟲HC29基因的克隆，特性分析
　　 根據(jù)已發(fā)表的mRNA部分序列的5，和3'末端設(shè)計(jì)引物，通過RACE獲得了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲HC29的全基因序列．HC29的cDNA序列全長為1113bp，擁有一個(gè)507bp的開放閱讀框，編碼一個(gè)168個(gè)氨基酸的蛋白，其預(yù)測分

4、子量為18.9kDa．通過對氨基酸序列的分析發(fā)現(xiàn)，HC29擁有保守的非硒依賴型GPX的催化三聯(lián)體和二聚體交聯(lián)界面．將預(yù)測的蛋白氨基酸序列和硫氧還蛋白樣家族的其他GPX同系物相比，擁有44.7-80.4％的相似率．進(jìn)化樹分析顯示HC29和其他GPX同系物序列有較高的進(jìn)化相似性，這些發(fā)現(xiàn)證明克隆出來的HC29是一個(gè)GPX蛋白，屬于硫氧還蛋白樣家族的一個(gè)成員．對HC29和先前報(bào)道的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的另外一個(gè)GPX的核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行比對分析發(fā)

5、現(xiàn)，HC29有著不同類型的剪接前導(dǎo)序列和二聚體交聯(lián)界面位點(diǎn)，但是二者的催化位點(diǎn)是一致的．對原核表達(dá)的重組HC29蛋白進(jìn)行特異性酶活力分析，顯示了降解H202的能力，這些發(fā)現(xiàn)都說明了HC29是一種新的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的GPX蛋白．2．捻轉(zhuǎn)血矛線蟲HC29 DNA疫苗的免疫保護(hù)性試驗(yàn)
　　 根據(jù)已經(jīng)克隆的HC29序列，將其構(gòu)建成DNA疫苗，并對其在山羊體內(nèi)的抗捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的免疫保護(hù)作用進(jìn)行研究，將15只山羊隨機(jī)分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，HC29組

6、的動(dòng)物在0天和14天免疫HC29 DNA疫苗，在28天攻擊5000條感染性三期幼蟲；非免疫陽性對照組只在28天攻擊5000條感染性三期幼蟲；同時(shí)一組非免疫非攻蟲動(dòng)物被設(shè)立為陰性對照組．結(jié)果顯示，HC29 DNA疫苗組于免疫之后在注射部位檢測出HC29抗原的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)．在攻蟲之后，HC29組動(dòng)物的每克糞便平均蟲卵計(jì)數(shù)和荷蟲率分別降低了36.1%和35.6%，在免疫之后，高水平的血清IgG，血清IgA和粘膜IgA被誘導(dǎo)產(chǎn)生，CD4+T淋巴細(xì)

7、胞和B淋巴細(xì)胞增加，外周血嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，血紅素水平下降．這些數(shù)據(jù)表明，重組的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲HC29谷胱甘肽過氧化物酶DNA疫苗能產(chǎn)生針對羊血矛線蟲的部分的保護(hù)作用．3．捻轉(zhuǎn)血矛線蟲肌撕裂蛋白（Dim-1）基因的克隆及免疫保護(hù)性試驗(yàn)研究
　　 由于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲肌撕裂蛋白(Dim-1)對宿主免疫系統(tǒng)具有強(qiáng)烈的免疫原性，所以Dim-1有望成為一種控制吸血線蟲病的良好的潛在疫苗候選基因．但是，關(guān)于Dim-I基因完整編碼序

8、列及保護(hù)能力的研究資料信息非常匱乏，在本研究中，根據(jù)已發(fā)表的mRNA部分序列的5'和3'末端設(shè)計(jì)引物，通過RACE獲得了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Dim-I的全基因序列．Dim-1的eDNA序列全長為1232bp，擁有一個(gè)966bp的開放閱讀框，編碼一個(gè)321個(gè)氨基酸的蛋白．以HC29 DNA疫苗保護(hù)性試驗(yàn)相關(guān)分組及試驗(yàn)方法為參考，將Dim-1構(gòu)建成DNA疫苗，并對其在山羊體內(nèi)的抗捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的免疫保護(hù)作用進(jìn)行研究．結(jié)果顯示，Dim-1 DNA疫苗組

9、于免疫之后在注射部位檢測出Dim-1抗原的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)．在攻蟲之后，Dim-1組動(dòng)物的每克糞便平均蟲卵計(jì)數(shù)和荷蟲率分別降低了45.7%和51.1%，在免疫之后，高水平的血清IgG、血清IgA和粘膜IgA被誘導(dǎo)產(chǎn)生，CD4+T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增加，外周血嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，血紅素水平下降．這些數(shù)據(jù)表明，重組的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Dim-1 DNA疫苗能產(chǎn)生針對羊血矛線蟲的部分的保護(hù)作用．4．捻轉(zhuǎn)血矛線蟲脂肪酶(Lipase)基因的克

10、隆與特性分析
　　 寄生蟲生活周期相關(guān)的基因被認(rèn)為是在發(fā)展替代控制策略方面具有良好的潛力．捻轉(zhuǎn)血矛線蟲脂肪酶（Lipase）對此寄生蟲的多個(gè)發(fā)育階段中的多項(xiàng)生命活動(dòng)都具有重要的生物學(xué)意義，有望成為一種控制吸血線蟲病的良好的潛在疫苗候選基因或者藥物標(biāo)靶。本篇試驗(yàn)研究中，使用cDNA末端快速擴(kuò)增法（RACE）獲得了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Lipase的全基因序列，并將序列登陸至GenBank（登錄號：HQ444390）．Lipase的cDNA序