釀酒酵母中應(yīng)激顆粒形成的相關(guān)基因及作用規(guī)律.pdf

1、當(dāng)真核細(xì)胞面臨逆境條件時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成由mRNA結(jié)合且體積較大的細(xì)胞質(zhì)顆粒物、核糖體元件和包括轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的RNA結(jié)合蛋白。在這些顆粒物形成的同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的mRNA暫時(shí)保持沉默，使細(xì)胞的能量集中在轉(zhuǎn)錄與生存相關(guān)的蛋白。在逆境下因細(xì)胞轉(zhuǎn)錄中斷而合成的顆粒物可以被降解，當(dāng)環(huán)境條件得到改善時(shí)重新進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在這些顆粒物中，有兩種蛋白組分不同的RNA顆粒被區(qū)分開來(lái)：應(yīng)激顆粒（Stress Granules），或稱應(yīng)力顆粒，及過(guò)程產(chǎn)物P小體（Pro

2、cessing Bodies）。其中P小體的體積較小，形狀規(guī)則，常態(tài)時(shí)在細(xì)胞中亦有分布。應(yīng)激顆粒是本課題主要的研究對(duì)象，它具有較大且不規(guī)則的形狀，由不翻譯的信使核糖核蛋白顆粒（messenger ribonucleoprotein particle，mRNP）組成，其組裝是由各種環(huán)境壓力引發(fā)的，包括熱激，碳匱乏，過(guò)氧化，高滲透壓，病毒感染，紫外線照射等，但不包括X射線照射和DNA損傷劑逆境。
　　形成RNA的細(xì)胞質(zhì)顆粒的能力是細(xì)胞

3、在壓力下生存的重要條件，也是打破自身凋亡和生存之間平衡的重要條件。對(duì)應(yīng)激顆粒形成相關(guān)基因及作用規(guī)律的研究，在對(duì)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeHansen）的應(yīng)激能力提供了分子層面的解釋的同時(shí)，對(duì)于其他真核細(xì)胞在逆境下的存亡選擇依據(jù)和哺乳動(dòng)物中癌細(xì)胞的形成機(jī)制也具有參考意義。至今，釀酒酵母（S. cerevisiae）中應(yīng)激顆粒的具體成分、形成條件以及逆境激活信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制等問(wèn)題尚不為人所知，說(shuō)明上述機(jī)制正

4、是本課題研究的目的。
　　釀酒酵母（S. cerevisiae）的全基因組測(cè)序已完成，而自動(dòng)化的合成遺傳陣列（Synthetic GeneticArray，SGA）分析技術(shù)和基因組水平的高通量的成像篩選技術(shù)也已經(jīng)研制成功?；谏鲜黾夹g(shù)條件，本研究將帶有紅色熒光蛋白的應(yīng)激顆粒標(biāo)記物PAB1-RFP轉(zhuǎn)化到釀酒酵母（S. cerevisiae）基因組中，再通過(guò)SGA的融合技術(shù)，對(duì)帶有PAB1-RFP標(biāo)記的4600株單基因敲除突變子和80

5、0株溫度敏感型突變子進(jìn)行應(yīng)激顆粒的逆境誘導(dǎo)，主要以脫氧葡萄糖處理為逆境條件，基于應(yīng)激顆粒豐度，篩選出與野生型差別較大的突變子，分析這些突變子缺失基因的功能與應(yīng)激顆粒組裝和分解之間的聯(lián)系，以此探明細(xì)胞在應(yīng)激顆粒形成過(guò)程中涉及的生物代謝途徑。
　　通過(guò)大規(guī)模篩選，發(fā)現(xiàn)了許多與應(yīng)激顆粒形成相關(guān)的功能基因。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)應(yīng)激顆粒形成所需基因集中在：胞內(nèi)體組分、核糖體組分、GARP復(fù)合物、EGO-GSE復(fù)合物和蛋白質(zhì)折疊。而導(dǎo)致應(yīng)激顆粒異常增多

6、的缺失基因多與生物體膜結(jié)構(gòu)、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)以及自噬作用相關(guān)，作用于應(yīng)激顆粒的分解。大多數(shù)表型突出的陰性突變子在面臨其他逆境條件時(shí)，如熱激、高滲透壓，仍然難以形成應(yīng)激顆粒，但有一部分突變子的陰性表型是針對(duì)特定的逆境條件的。那些缺失后致使應(yīng)激顆粒無(wú)法形成的蛋白，大多集中在低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)區(qū)域，說(shuō)明很多非緊密結(jié)合的大分子與應(yīng)激顆粒的結(jié)構(gòu)完整性密切相關(guān)。熱激能在誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒形成的同時(shí)提高芽殖酵母的突變頻率，一些應(yīng)激顆粒形成困難的突變子在熱激中顯示出更高的

7、突變率，而這種特性僅存在于熱激逆境下。篩選結(jié)果中的幾個(gè)影響應(yīng)激顆粒形成的突變會(huì)影響到Ran GTP酶和TOR代謝通路，調(diào)控RNA和蛋白質(zhì)的核質(zhì)運(yùn)輸。
　　在應(yīng)激顆粒形成困難的突變子中，逆境調(diào)控的信號(hào)蛋白的轉(zhuǎn)錄達(dá)到了極端的程度：逆境誘導(dǎo)的mRNA積累的比野生型更多，然而被逆境抑制的mRNA在這些突變子中也更為劇烈的減少。這些結(jié)果說(shuō)明應(yīng)激顆粒不僅被PKA，HOG等逆境信號(hào)通路所調(diào)控，并且它也能調(diào)節(jié)逆境反應(yīng)的程度。據(jù)推斷，RNA結(jié)合蛋白

8、的往復(fù)的核質(zhì)運(yùn)動(dòng)負(fù)責(zé)逆境中的基因表達(dá)調(diào)控，應(yīng)激顆粒正是這種核質(zhì)運(yùn)動(dòng)的調(diào)控者。逆境下應(yīng)激顆粒組裝能力強(qiáng)的細(xì)胞有生殖能力和適應(yīng)能力更強(qiáng)的傾向。反之，應(yīng)激顆粒的缺失可能導(dǎo)致逆境條件下細(xì)胞出現(xiàn)過(guò)度的有害反應(yīng)。應(yīng)激顆粒的組裝可能是細(xì)胞對(duì)疊加逆境的應(yīng)激反應(yīng)減弱的原因之一。
　　此外，本課題還對(duì)釀酒酵母（S. cerevisiae）細(xì)胞在衰老過(guò)程中產(chǎn)生的損傷蛋白聚集體和應(yīng)激顆粒進(jìn)行了對(duì)比分析，首先觀察到這兩者之間并不存在共定位關(guān)系，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)細(xì)胞