與茶酚類澀味物質(zhì)合成相關(guān)的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因的篩選和功能驗(yàn)證.pdf

1、兒茶素（黃烷-3-醇）和黃酮醇糖苷，作為茶葉中主要的保健和藥理成分，是茶葉中主要存在的茶多酚，也是紅茶和綠茶茶湯中典型的苦澀味化合物。前期研究工作表明，酯型兒茶素的合成涉及一種UDP-葡萄糖：沒(méi)食子酰-1-O-β-D-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UGGT),其中沒(méi)食子酸（GA）在 UGGT作用下，接受糖供體UDP-葡萄糖的糖基團(tuán)而轉(zhuǎn)化成1-O-β-D-沒(méi)食子酰葡萄糖（βG）。茶葉中黃酮醇-3-O-糖苷的形成依賴黃酮醇-3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（F3GT）

2、的催化。UGGT和F3GT均屬于糖基轉(zhuǎn)移酶中GT1家族，直接或間接參與了茶樹(shù)澀味化合物的生物合成。因此，篩選參與澀味物質(zhì)合成相關(guān)UGT基因并研究及其功能，對(duì)茶樹(shù)育種和茶葉品質(zhì)調(diào)控具有非常重要的意義。
　　本論文通過(guò)基于NCBI-blastp分析和在線軟件Jpred軟件預(yù)測(cè)的基因篩選技術(shù)，對(duì)茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中UGTs序列進(jìn)行了篩選；利用FULL-RACE技術(shù)對(duì)候選基因進(jìn)行了全長(zhǎng)克??；利用進(jìn)化樹(shù)分析及同源建模對(duì)候選的UGT基因進(jìn)行功能

3、預(yù)測(cè)；利用原核表達(dá)和酶活性檢測(cè)技術(shù)驗(yàn)證了候選基因的功能。主要研究結(jié)果如下：
　　1.利用NCBI-blastp軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的GT序列進(jìn)行搜索，結(jié)果顯示CsUGT84A1與已鑒定功能的三條葡萄VvgGTs一致性達(dá)到80％以上，因此，選擇CsUGT84A1為候選UGGT基因，并做進(jìn)一步功能驗(yàn)證。此外，通過(guò)在線軟件Jpred對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的GT序列進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，CsUGT78E1和CsUGT78F1基因編碼的氨基

4、酸序列與已知葡萄UDP-葡萄糖：花青素3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(accession number:P51094.2，PDB id:2c9z,VvGT1)的最相似，一致性分別為55%和53%，因此，選擇CsUGT78E1和CsUGT78F1為類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)的候選基因，并做進(jìn)一步功能驗(yàn)證。
　　2.通過(guò)FULL-RACE全長(zhǎng)克隆技術(shù)，克隆了CsUGT84A1、CsUGT78E1和CsUGT78F1的cDNA全長(zhǎng)序列，并經(jīng)U

5、GT命名委員會(huì)統(tǒng)一命名為CsUGT84A22、CsUGT78A14和CsUGT78A15。使用MEGA軟件，對(duì)三條基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析和功能預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：CsUGT84A22分布在L組，屬于為1-O-?；?葡萄糖酯糖基轉(zhuǎn)移酶分支，而CsUGT78A14和CsUGT78A15分布在類黃酮-3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)化樹(shù)分支。
　　3.利用PyMoL軟件，以VvGT1的2c9z為模板，對(duì)CsUGT78A14和CsUGT78A

6、15進(jìn)行同源建模并進(jìn)一步預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)的功能。同源建模分析表明CsUGT78A14和CsUGT78A15與葡萄VvGT1的2c9z晶體結(jié)構(gòu)具有高度相似性。經(jīng)ClustalX多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CsUGT78A14和CsUGT78A15與葡萄VvGT1的催化殘基位點(diǎn)具有高度的相似性，但是在保守基序PSPG box最后一個(gè)氨基酸殘基上表現(xiàn)出Q(Gln)和H(His)的差異，并由此推測(cè)，CsUGT78A14和CsUGT78A15可能分別負(fù)責(zé)茶樹(shù)中黃

7、酮醇3-O-葡萄糖苷和黃酮醇-3-O-半乳糖苷的合成。
　　4.利用構(gòu)建的pMAL-c2x-CsUGT84A22、pMAL-c2x-CsUGT78A14和pMAL-c2x-CsUGT78A15重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌Novablue(DE3)，并在1 mmol/L IPTG濃度和28℃條件下誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)；使用直鏈淀粉樹(shù)脂對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的融合蛋白進(jìn)行純化；通過(guò)HPLC和UPLC-MS/MS分析和鑒定技術(shù)，對(duì)融合蛋白的酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行

8、檢測(cè)。結(jié)果顯示，重組蛋白CsUGT84A22（rCsUGT84A22）融合蛋白能夠催化GA形成糖苷化的沒(méi)食子酸βG；而重組蛋白CsUGT78A14（rCsUGT78A14）和重組蛋白CsUGT78A15（rCsUGT78A15）可以分別催化黃酮醇轉(zhuǎn)變成黃酮醇-3-O-葡萄糖苷和黃酮醇-3-O-半乳糖苷。
　　5.酶動(dòng)力學(xué)分析表明，苯甲酸類衍生物中的沒(méi)食子酸GA和苯丙酸衍生物中的對(duì)香豆酸是rCsUGT84A22融合蛋白的最適底物。U