紅曲霉色素合成相關基因的篩選.pdf

1、紅曲霉（Monascus spp.）作為一類天然色素和功能性食品添加劑的發(fā)酵菌株應用廣泛，尤其是在亞洲的許多國家。紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的色素具有許多對人體有用的特性，例如消炎、減肥、抗動脈粥樣硬化以及抗癌的有益功效。除了色素以外，紅曲霉的其他次級代謝產(chǎn)物，如莫納可林K，γ-氨基丁酸(GABA)等也具有降血壓、降血脂、抗氧化、抗癌及免疫調(diào)節(jié)的功能。但是隨之產(chǎn)生的真菌毒素-桔霉素嚴重的阻礙了這些有益的紅曲發(fā)酵產(chǎn)物的應用和出口。到目前為止，與紅曲霉

2、次級代謝產(chǎn)物及其調(diào)控機制有關的分子生物學信息比較匱乏，對于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)色素沒有很好地指導作用，因此從分子水平揭示紅曲霉的代謝調(diào)控機制就顯得尤為重要。在本研究中，通過雙向電泳技術分析產(chǎn)色素水平差異較大的兩組菌體，從而篩選與色素合成相關的基因并通過基因敲除的技術進行驗證。
　　本實驗通過對大米、果糖、蔗糖、淀粉、葡萄糖和麥芽糖這六種碳源進行色素規(guī)律的研究，這六種培養(yǎng)基大米產(chǎn)色素能力最強，然后依次是果糖、葡萄糖、淀粉、麥芽糖，產(chǎn)色素能力

3、最低的是蔗糖。通過比較各種培養(yǎng)基和色素的關系最終選定淀粉和蔗糖分別作為高產(chǎn)和低產(chǎn)色素培養(yǎng)基的碳源。選取第8天進行全蛋白的分析，其中淀粉作為主要碳源產(chǎn)生紅、橙、黃三種色素的色價分別為3442.25 U/g、3148.13 U/g、3703.43 U/g;蔗糖作為主要碳源產(chǎn)生三種色素的色價分別為555.49 U/g、396.66 U/g、1001.28 U/g。通過雙向電泳找到了72個差異點，通過質(zhì)譜鑒定64個蛋白點被成功鑒定出來。對這些差

4、異蛋白進行相似的數(shù)據(jù)分析與資料查閱，得到了11個與色素合成相關的蛋白。
　　為了驗證與色素合成相關的基因，選取c5.123(salicylate hydroxylase)和c5.133(Aflatoxin B1 aldehyde reductase)兩個基因進行敲除。根據(jù)基因序列設計引物，擴增出含有特定酶切位點的上下游片段，利用重組DNA技術將上下游連接到pUCH2-8載體的潮霉素基因兩端，成功構建出高特異性的長片敲除載體。其中c