木質(zhì)纖維素水解液抑制物高抗性酵母的選育.pdf

1、纖維素水解液抑制物對微生物的毒害作用是纖維素乙醇發(fā)展面臨的主要瓶頸問題之一。本文主要借助分子生物學相關手段和進化工程方法來選育纖維素水解液抑制物抗性提高的酵母菌株。一方面，通過基因工程改造等手段實現(xiàn)膜轉(zhuǎn)運蛋白基因的過表達來構(gòu)建抗性提高的釀酒酵母;另一方面，通過定向馴化的方法來篩選得到具有良好抑制物抗性的酵母菌株。
　　首先，利用基因工程改造相關手段獲得膜轉(zhuǎn)運蛋白基因ADP1，STE6, MDR1，TPO1過表達的釀酒酵母菌株Sac

2、charomyces cerevisiae280/959-PGK-ADP1/MDR1/STE6/TPO1和空載對照菌株S.cerevisiae280/959-PGK。并通過抑制物脅迫條件下的梯度稀釋實驗和發(fā)酵實驗進行驗證，結(jié)果表明:在甲酸、乙酸、糠醛等抑制物脅迫條件下，過表達菌株S.cerevisiae280-PGK-MDR1和S.cerevisiae959-PGK-ADP1在生長速率、耗糖速率、乙醇生產(chǎn)強度等方面與其對照菌株相比具有明

3、顯優(yōu)勢。
　　其次，本研究利用進化工程的方法對釀酒酵母模式菌株S.cerevisiae959在含有甲酸、乙酸的條件下分別進行了定向馴化，并將馴化后的菌株進行抑制物抗性的考察和驗證。結(jié)果表明，馴化后的菌株在相應抑制物的脅迫條件下仍然可以以較快的速率生長，消耗葡萄糖并生成乙醇。此外，經(jīng)過甲酸馴化后的菌株對乙酸和混合酸的抗性也得到了提高，而經(jīng)過乙酸馴化的菌株在甲酸或混合酸存在的條件下與對照菌株相比并沒有特別明顯的優(yōu)勢。
　　在上述

4、實驗的基礎上，本研究對能夠天然利用多種碳源（己糖和戊糖）的馬克斯克魯維酵母進行了定向馴化，其馴化條件為模擬纖維素水解液中的混合抑制物條件，同時對馴化后的菌株進行了抑制物抗性的考察和發(fā)酵實驗驗證。結(jié)果表明，馴化后的菌株與出發(fā)菌株相比，對纖維素水解液抑制物的抗性顯著提高。此外，經(jīng)過馴化后的菌株K.marxianus1727-1和K.marxianus1727-5不僅在抑制物抗性方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，對木糖的消耗速率也有了顯著提高。