釀酒酵母對木質(zhì)纖維素水解液中抑制物香草醛耐受性機制的解析.pdf

1、木質(zhì)纖維素是地球上儲量豐富的可再生資源，以其為原料的生物煉制技術成為近年來的研究熱點。木質(zhì)纖維素原料需要經(jīng)過預處理以獲得可發(fā)酵的糖類，而預處理環(huán)節(jié)不可避免地產(chǎn)生對微生物生長不利的抑制物，主要有有機弱酸、呋喃醛類和酚類化合物。因此，提高微生物的耐受性是木質(zhì)纖維素生物煉制技術的瓶頸問題之一。存在于木質(zhì)纖維素水解液中的酚類化合物種類繁多，對微生物的危害也強于其他兩類抑制物，且相關研究較少。香草醛是木質(zhì)纖維素水解液中的一種主要酚類化合物。

2、>　　釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是傳統(tǒng)乙醇生產(chǎn)菌，具有良好的生產(chǎn)性能，廣泛用于生物煉制底盤細胞改造，以生產(chǎn)第二代燃料乙醇及其他生物基化學品。本實驗室前期工作對一株發(fā)酵性能良好的二倍體工業(yè)菌株NAN-27進行EMS（甲基磺酸乙酯）誘變處理，得到一株木質(zhì)纖維素水解液耐受性有所提高的菌株EM-13，繼而對其在木質(zhì)纖維素水解液中進行長期適應性馴化后，得到了一株香草醛高耐受性菌株EMV-8，且該菌株具有較高的還原

3、香草醛為低毒性的香草醇的能力。進一步對EMV-8和NAN-27進行了轉錄組差異表達分析?；诖?，本研究通過轉錄組學和基因組學技術，發(fā)掘EMV-8中香草醛耐受性相關元件（基因）。
　　本文主要研究進展:
　　1.介導香草醛高耐受性氧化還原酶的鑒定與機制研究
　　釀酒酵母菌株自身能夠通過內(nèi)源氧化還原酶將香草醛還原成低毒的香草醇，這一能力與菌株的香草醛耐受性密切相關。有報道稱醇脫氫酶Adh6p參與釀酒酵母中香草醛的還原，但與

4、出發(fā)菌株NAN-27相比，EMV-8中ADH6轉錄水平?jīng)]有明顯變化。因此，本文的第一項工作是分析鑒定在EMV-8中與香草醛還原過程相關的氧化還原酶。我們首先聚焦的是在EMV-8中轉錄水平上調(diào)2倍以上的67個氧化還原酶基因（與NAN-27相比），結合對這些基因的功能解讀，確定16個備選基因，連同ADH6一起進行后續(xù)研究。由于二倍體工業(yè)酵母的基因操作較不便，我們在易于基因操作且發(fā)酵性能良好的單倍體實驗室菌株CEN.PK102-3A中超表達備

5、選基因。在香草醛脅迫下，對超表達氧化還原酶的重組菌株進行搖瓶發(fā)酵，結果顯示，其中5個基因?qū)︶劸平湍傅南悴萑└吣褪苄杂蟹e極作用，即:ADH6——醇脫氫酶Adh6p基因，ALD6——乙醛脫氫酶Ald6p基因，ZWF1—葡萄糖-6-磷酸脫氫酶Zwf1p基因，以及只有系統(tǒng)名的YNL134C——ALD6、YNL134C和YJR096W促進釀酒酵母最大比生長速率分別提高了177％、25％、15％和18％。而超表達ADH6和ZWF1，使釀酒酵母的香草

6、醛比消耗速率分別提高了800％和26％。
　　進一步測定上述5個氧化還原酶的粗酶液以香草醛為底物的還原酶活性。結果顯示，與只表達空載體的對照菌株相比，Adh6p以NADPH為輔酶的香草醛還原酶活性提高了350％，YNL134C編碼的還原酶以NADH為輔酶的香草醛還原酶活性提高了153％，YJR096W編碼的還原酶以NADPH和NADH為輔酶的香草醛還原酶活性分別提高了69％和45％。進一步分析超表達這5個氧化還原酶對細胞內(nèi)還原型/

7、氧化型輔酶比例的影響，結果顯示，超表達ALD6或ZWF1分別使細胞內(nèi)的NADPH/NADP+的比例提高了96％和55％，而超表達其他基因沒有改變輔酶還原型/氧化型的比例。
　　該研究結果豐富了提高釀酒酵母香草醛耐受性的氧化還原酶，并解析了這些氧化還原酶對香草醛的可能解毒機制:Adh6p及YJR096W和YNL134C編碼的還原酶直接還原香草醛;Ald6p和Zwflp提供更多的還原型輔酶(主要是NADPH)。
　　2.香草醛高

8、耐受性菌株EMV-8的基因組突變研究
　　本文進一步對親本菌株NAN-27、過渡菌株EM-13和香草醛高耐受性菌株EMV-8進行基因組測序，以挖掘EMV-8中香草醛耐受性相關的DNA突變。突變發(fā)生可以發(fā)生在編碼區(qū)和非編碼區(qū)，本文主要關注編碼區(qū)的突變。EM-13和EMV-8的編碼區(qū)序列分別與出發(fā)菌株NAN-27編碼區(qū)序列進行對比，進一步排除兩株菌株共同突變的基因，得到僅在EMV-8中發(fā)生的突變基因:275個非同義SNP（單核苷酸多態(tài)

9、性）突變基因和11個InDel（插入或缺失）突變的基因。鑒于只有EMV-8的香草醛耐受性顯著提高，因而我們主要關注這些只在EMV-8中發(fā)生突變的基因。為排除基因組測序的誤差，對突變位點進行PCR及Sanger測序驗證，在已驗證的59個非同義SNP突變的基因中，有14個基因被證實發(fā)生突變。11個InDel突變基因中，有7個基因被證實發(fā)生InDel突變。對非同義SNP突變的基因驗證工作還在進行中，因此本文主要對InDel突變基因進行功能驗證

10、。
　　一般地，InDel突變主要是引起相關蛋白的功能喪失，因而，我們在單倍體實驗室菌株BY4741（未選用第一部分工作所用CEN.PK102-3A菌株，是由于有組學數(shù)據(jù)顯示該菌株缺少了部分突變基因）中分別敲除7個InDel突變基因(MFG1、YNL195C、PAU17、YVH1、PPM2、YRR1和RBG1)，產(chǎn)生的缺失突變體在含香草醛的平板上進行菌體梯度定量生長實驗。結果顯示，YRR1缺失突變體BY4741(yrr1Δ)表現(xiàn)出

11、良好的香草醛耐受性。同時，液體發(fā)酵結果顯示，在香草醛脅迫條件下，BY4741(yrr1Δ)的最大比生長速率和香草醛的比消耗速率分別比出發(fā)菌株BY4741提高了142％和50％。進一步，在缺失菌株BY4741(yrr1Δ)，通過質(zhì)?；匮a該基因時，菌株香草醛耐受性則明顯下降，證實了其編碼蛋白Yrr1p對香草醛耐受性的不利作用。
　　YRR1編碼具有鋅指結構的轉錄因子Yrr1p，能夠激活多藥抗性相關基因的表達。此前相關研究報道均顯示Yr

12、r1p對細胞的藥物(4-硝基喹啉-N-氧化物、水楊酸、戴森錳鋅等)耐受性具有積極作用。本文首次觀察到Yrr1p對香草醛耐受性具有負面作用。
　　3.轉錄因子基因YRR1缺失提高香草醛耐受性機制的研究
　　鑒于YRR1編碼蛋白Yrr1p是藥物耐受性相關轉錄因子，本文利用RNA-Seq技術，在有或無香草醛脅迫條件下對BY4741和BY4741(yrr1Δ)進行基因差異表達分析。結果顯示，在無香草醛脅迫的條件下，YRR1缺失引起的

13、基因差異表達并不顯著。在香草醛脅迫的條件下，BY4741和BY4741(yrr1Δ)間共有217個基因的轉錄水平發(fā)生明顯變化。對這217個差異表達基因進行功能聚類分析，這些基因的功能主要涉及氧化還原酶、物質(zhì)轉運、rRNA加工和核糖體合成等生物學過程。根據(jù)差異表達顯著程度，并主要結合對相關基因的功能解讀，本文選定醇脫氫酶編碼基因ADH7，ABC轉運蛋白相關基因PDR5和SNQ2，及rRNA加工和核糖體合成相關基因NMD3、SSF1、NSR

14、1、DBP2、DBP9、HAS1、PRP43、MTR4為目標進一步研究。
　　YRR1缺失提高了菌株還原香草醛的能力。在香草醛脅迫下，已報道能有效催化香草醛還原的醇脫氫酶基因ADH7在菌株BY4741(yrr1Δ)中的表達水平是野生型對照菌株中的7倍。為此，在該脅迫條件下，分別測定BY4741和BY4741(yrr1Δ)的細胞粗酶液以香草醛為底物的還原酶活性。結果表明，BY4741(yrr1Δ)的粗酶液以NADPH為輔酶的香草醛還

15、原酶活性較出發(fā)菌株BY4741高出95％。結合BY4741(yrr1Δ)的香草醛比消耗速率較BY4741提高的現(xiàn)象，表明，提高菌株還原香草醛的能力是YRR1缺失提高香草醛耐受性的機制之一。在BY4741(yrr1Δ)菌株中進一步敲除ADH7，BY4741(yrr1Δadh7Δ)依然表現(xiàn)出良好的香草醛耐受性，這說明BY4741(yrr1Δ)中還有其他基因?qū)ο悴萑┠褪苄云鹱饔谩?br>　　YRR1缺失強化了ABC轉運蛋白的功能。在香草醛脅迫

16、條件下，與出發(fā)菌株BY4741相比，BY4741(yrr1Δ)中ABC轉運蛋白相關基因PDR5和SNQ2表達水平升高。ABC轉運蛋白能夠外排毒性物質(zhì)。因此，在BY4741菌株中超表達了PDR5和SNQ2。結果顯示，超表達這些ABC轉運蛋白在無香草醛脅迫時抑制細胞生長。但在香草醛脅迫下，超表達PDR5和SNQ2加快了菌體生長，菌株延滯期縮短。因此，ABC轉運蛋白表達量提高是YRR1缺失提高菌株對香草醛的耐受性的機制之一。
　　YRR

17、1缺失促進了核糖體合成及rRNA加工過程，其中提高RNA解旋酶基因DBP2的表達水平對菌株香草醛耐受性有積極作用。香草醛嚴重抑制野生型菌株BY4741的核糖體合成途徑和rRNA加工過程。與之形成對比的是，在香草醛存在條件下，缺失YRR1解除了這種抑制，大約12％的核糖體合成相關的基因在BY4741(yrr1Δ)響應香草醛時發(fā)生上調(diào)。其中4個基因(SSF1、NMD3、NSR1和DBP2)，在BY4741(yrr1Δ)響應香草醛時（與無抑制

18、物條件比較）表達上調(diào)，而在BY4741響應香草醛時（與無抑制物條件比較）表達下調(diào)，呈現(xiàn)相反的變化。這一相反變化可能是YRR1缺失引起的。在BY4741中分別超表達這4個基因，并在香草醛的脅迫下，進行液體發(fā)酵實驗。結果顯示，超表達RNA解旋酶基因DBP2能夠顯著提高菌株的香草醛耐受性，菌株的最大比生長速率和香草醛比消耗速率分別提高了7％和59％。其他基因?qū)甑南悴萑┠褪苄詻]有影響。
　　RNA解旋酶能夠參與細胞內(nèi)一切RNA相關的活

19、動，包括核糖體大小亞基(60S和40S)的合成。Dbp2p參與核糖體大亞基合成。香草醛被報道可以抑制核糖體大亞基合成，因此推測Dbp2p在香草醛耐受性中起到了加強核糖體大亞基合成的作用。同時，本文也關注了在BY4741(yrr1Δ)中表達上調(diào)的其它RNA解旋酶基因。按照它們參與的生物學過程，對參與大亞基合成的MTR4、DBP9，同時參與大小亞基合成的PRP43、HAS1，以及只參與小亞基合成的DBP4進行功能驗證，遺憾的是這些基因的超表

20、達并沒有提高菌株的香草醛耐受性。
　　綜上所述，本文通過轉錄組學和基因組學，在綜合分析大數(shù)據(jù)的基礎上，結合遺傳學及分子生物學技術，挖掘出釀酒酵母提高香草醛耐受性的新元件:氧化還原酶Ald6p、Zwf1p以及YNL134C和YJR096W編碼的蛋白，轉錄因子Yrr1p，RNA解旋酶Dbp2p，ABC轉運蛋白Pdr5p和Snq2p。首次證實轉錄因子Yrr1p對香草醛耐受性的具有負面作用，并證實一些ABC轉運蛋白、參與核糖體合成及rRN