兩種茶樹內源糖苷酶基因的表達、抗體制備及在不同品種中的差異表達研究.pdf

1、茶樹，我國重要的經濟作物；茶，世界三大非酒精飲料之一，有著重要的經濟價值，其香氣是影響茶葉品質優(yōu)劣的重要因素。茶香中主要的揮發(fā)性物質單萜烯醇和芳香族醇等多以糖苷形式存在，且以櫻草糖苷和葡萄糖苷為主。研究表明，茶鮮葉經物理損傷后，細胞分室被破壞，致使內源糖苷酶與萜類香氣苷元發(fā)生酶促水解反應，進而釋放出香氣。β-櫻草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶是茶葉中主要的內源糖苷酶。
　　茶樹糖苷類香氣前體不僅是茶葉香氣形成的基礎，而且參與了茶樹對病蟲害

2、的防御。對于茶樹內源糖苷酶已有相關報道，其克隆和表達工作也取得一定進展，但茶樹中的β-櫻草糖苷酶（Pri）和β-葡萄糖苷酶（Glu）未能固化并用于生產，且至今未有商業(yè)化抗體出售，這對從蛋白水平上研究內源糖苷酶造成了困難。
　　本文通過克隆并表達關鍵性的內源糖苷酶，對內源糖苷酶進行多克隆抗體的制備和對不同茶樹品種中內源糖苷酶基因表達差異分析，以及對茶葉萎凋過程中β-葡萄糖苷酶活性變化的研究等，以期達到如下目的：提高大家對茶葉香氣形成

3、機理的了解，為提高茶葉香氣品質奠定基礎；為從蛋白水平上了解內源糖苷酶的表達差異提供可能；為茶樹種質鑒定提供分子標記；為茶葉加工優(yōu)化提供一定的理論指導。主要研究結果如下：
　　1、根據(jù)本課題組從茶葉中分離純化的可水解葡萄糖苷類香氣前體的β-葡萄糖苷酶（Glu）的cDNA全長序列，和GenBank登陸的β-櫻草糖苷酶（Pri）基因序列，設計原核表達引物。通過RT-PCR擴增獲得Glu和Pri基因片段，分別插入pET-32(+)和pMA

4、L-c5X中，成功構建表達載體pET-32a(+)-Pri/Glu、pMAL-c5X-Pri/Glu和去信號肽pMAL-c5X-Pri/Glu。經IPTG誘導后，SDS-PAGE檢測后發(fā)現(xiàn)，pET-32a(+)-Pri/Glu得到高效表達，但以包涵體形式存在，未檢測到酶活性；pMAL-c5X-Pri/Glu未能表達；而去信號肽pMAL-c5X-Pri/Glu可在表達菌株BL21(DE3)中，經1 mM IPTG，16℃，誘導20 h后可

5、溶性蛋白表達量最高，但未檢測到酶活性。
　　2、將pET-32a(+)-Pri/Glu載體表達產生的包涵體蛋白經 Ni-NTA親和層析柱純化，制備出Glu和 Pri多克隆抗體?？贵w經ELISA與Western-blot檢測，效價為1∶100000，且具有特異性。通過抗體與茶樹種子總蛋白的特異性結合，表明β-櫻草糖苷酶也可能存在于茶樹種子中。
　　3、設計Glu真核表達引物，通過RT-PCR擴增獲得Glu基因片段，插入pESC

6、-HIS，成功構建表達載體pESC-HIS-Glu。經半乳糖誘導表達后，SDS-PAGE分析及Western-blot檢測表明蛋白得到表達。pNPG法酶活性檢測結果表明，該表達蛋白具有活性，活性為0.24±0.03 U。
　　4、利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術，研究了Pri、Glu兩個基因在13個茶樹品種中的表達情況。結果顯示：在安徽7號及早逢春兩個品種中相對表達量均較高；香型較為突出的多抗香和悅茗香兩個品種中Pri

7、與Glu基因的表達量較高；大部分早生種中兩個基因的相對表達量高于中生種。
　　5、對室內萎凋攤放0、2、4、6、8、10 h的五個茶樹品種葉片的含水量和β-葡萄糖苷酶活性進行了研究，結果表明：萎凋時間造成的酶活性差異不顯著(P>0.05)，而品種對酶活性的差異達到了極顯著水平(P<0.01)。這表明不同品種間β-葡萄糖苷酶活性差異較大，品種的選擇對茶葉香氣的影響更為重要。萎凋過程中，含水量從80％降至52%左右，處于線性下降水平；