沙門菌體內耐藥誘導模型的建立及體外誘導耐藥菌RNA-seq分析.pdf

1、沙門菌是一類常見的人畜共患病原菌，絕大多數(shù)對人和動物致病，可造成人和動物的傷寒、副傷寒、敗血癥和食物中毒等疾病，是公共衛(wèi)生的重要威脅。隨著氟喹諾酮類藥物（fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）的普遍使用，沙門菌對FQs的耐藥水平不斷升高，耐藥問題日益嚴重。目前通常使用FQs對敏感菌進行體外誘導來研究耐藥機制，但是體外誘導并不能確切反映沙門菌在體內時的耐藥性產(chǎn)生機理，因為動物體內是復雜的生物環(huán)境，機體的代謝、免疫機制等都可能會對細菌的

2、耐藥機理產(chǎn)生影響。本研究以秀麗隱桿線蟲N2野生型為宿主，將鼠傷寒沙門菌ATCC13311定植于線蟲體內，然后使用梯度濃度遞增法提高培養(yǎng)液中的環(huán)丙沙星濃度，誘導在線蟲體內的沙門菌產(chǎn)生耐藥性，同時進行體外誘導耐藥實驗。分別擴增體內誘導和體外誘導耐藥菌的gyrA、gyrB、parC和parE基因的氟喹諾酮耐藥決定區(qū)（Quinolone resistance determining regions，QRDR）以及外排泵抑制子基因（acrR、ma

3、rR、ramR和soxR），對PCR擴增產(chǎn)物進行測序和分析。然后分別構建鼠傷寒沙門菌ATCC13311和體外誘導耐藥株的轉錄組測序文庫并進行Illumina RNA-seq雙向測序，對ATCC13311和體外誘導耐藥菌的轉錄組測序結果進行數(shù)據(jù)分析。最后采用熒光定量PCR技術對轉錄組測序結果進行驗證。
　　結果表明，鼠傷寒沙門菌ATCC13311可以穩(wěn)定定植于線蟲體內，在線蟲消化道內集中分布于咽部和腸道，經(jīng)過環(huán)丙沙星誘導后可產(chǎn)生穩(wěn)定

4、耐藥菌株。經(jīng)過誘導后得到環(huán)丙沙星MIC為4μg/mL的耐藥菌TN4，體外誘導實驗獲到了環(huán)丙沙星MIC為4μg/mL的耐藥菌TW4。TN4的gyrA基因發(fā)生了Asp87Asn突變。體外誘導耐藥菌TW4的gyrA基因發(fā)生了Ser83Phe和Asp87Val突變，ramR基因出現(xiàn)了20bp的缺失。
　　對ATCC13311和體外誘導耐藥菌TW4進行RNA-seq測序后獲得了4.46 G有效數(shù)據(jù)，通過de novo拼接，獲得了311條un

5、igene，平均長度為15587 bp。拼接所得到的全序列長度為4847532 bp，經(jīng)預測4998條基因中有4902條得到GO注釋。采用COG功能將注釋基因劃分為25類，共有3735個基因得到注釋。將TW4與ATCC13311相比較，有3434個基因表達量顯著上升，32個基因表達量顯著下降，7條代謝途徑表達差異顯著。對表達量改變明顯的基因進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)22個與耐藥直接相關或者與藥物轉運系統(tǒng)相關基因表達量顯著上升。熒光定量PCR結果顯示

6、acrB、acrD和soxS的基因表達量與RNA-seq結果趨勢一致，證實RNA-seq可靠。
　　本研究建立了鼠傷寒沙門菌-秀麗隱桿線蟲體內耐藥性誘導模型，并比較了體內誘導耐藥菌和體外誘導耐藥菌的基因突變差異。利用轉錄組測序技術（RNA-seq）對鼠傷寒沙門菌ATCC13311和其誘導耐藥株TW4進行研究，揭示了鼠傷寒沙門菌耐藥性誘導前后差異表達的基因和顯著變化的代謝途徑，為深入研究細菌耐藥機制及與細菌代謝途徑之間的聯(lián)系提供重要