保加利亞乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶合成共軛亞油酸研究.pdf

1、共軛亞油酸(Conjugatede linoleic acid，CLA)是具有共軛雙鍵的18個(gè)碳原子的不飽和脂肪酸。CLA具有一系列的位置和幾何異構(gòu)體，其中c9，t11-CLA和t10，c12-CLA兩種異構(gòu)體被認(rèn)為最具有生物活性，研究發(fā)現(xiàn)這兩種異構(gòu)體具有抗腫瘤、抗粥樣動(dòng)脈硬化、減肥、免疫調(diào)節(jié)、抗糖尿病等功能。共軛亞油酸天然存在較少，主要靠人工合成，生物法合成共軛亞油酸具有反應(yīng)條件溫和，異構(gòu)體成分單一的優(yōu)點(diǎn)，可用于食品和藥品的添加，而亞

2、油酸異構(gòu)酶做為合成中的重要酶近年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)。
　　 本文以保加利亞乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶為研究對(duì)象，首先在產(chǎn)物分析鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)保加利亞乳桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究，其次研究酶的分離純化條件和酶學(xué)性質(zhì)，并對(duì)酶的反應(yīng)體系進(jìn)行了初步研究。
　　 氣質(zhì)聯(lián)用色譜和液相色譜檢測(cè)結(jié)果表明：保加利亞乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶可以合成CLA，其中含有兩種異構(gòu)體，主要產(chǎn)物為c9，t11-CLA。
　　 誘導(dǎo)產(chǎn)酶條件研究表明，在脫脂乳培

3、養(yǎng)基中添加1.5‰(v/v)LA所產(chǎn)酶的共軛亞油酸轉(zhuǎn)化率最高；溫度為36℃，培養(yǎng)36h為較適的培養(yǎng)條件；單獨(dú)添加0.1％(m/v)的乳糖或0.1％(m/v)的氯化鈉有利于誘導(dǎo)產(chǎn)酶；在培養(yǎng)基中直接添加LA的效果優(yōu)于培養(yǎng)3至12h后再進(jìn)行添加。
　　 亞油酸異構(gòu)酶的最佳提取條件為，以0.7％(m/v)的量添加溶菌酶(30℃，1h)，然后在冰水浴中超聲破碎(超聲3S，間歇4S，90次，功率400W)。粗酶液經(jīng)過(guò)40～80％飽和度的硫酸

4、銨進(jìn)行鹽析，millipore超濾管進(jìn)行超濾，SephadexG-100凝膠過(guò)濾層析的步驟進(jìn)行分離純化后，酶的純化倍數(shù)達(dá)到5.17倍，比活力為244.78[U/mg]。純化后的亞油酸異構(gòu)酶在SDS-PAGE電泳中只有一條條帶，達(dá)到電泳純度，分子量為42.69KDa。
　　 亞油酸異構(gòu)酶的酶學(xué)特性表明：保加利亞乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，在20～40℃范圍內(nèi)酶有較高的穩(wěn)定性；最適反應(yīng)pH值為4.0，pH值在3.0～6

5、.0范圍內(nèi)有較高的穩(wěn)定性；低濃度(0.01mol/L)的金屬離子Ca2+，Zn2+，Mg2+可利于亞油酸異構(gòu)酶的催化反應(yīng)，其影響順序分別為Ca2+＞Zn2+＞Mg2+；高濃度(0.02mol/L)的SDS有利于亞油酸異構(gòu)酶的純化反應(yīng)；以亞油酸為底物的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程得到，Km=3.87mmol/L，Vmax=4.35mmol/mL·h。
　　 亞油酸異構(gòu)酶反應(yīng)體系初步研究表明：保加利亞乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶在緩沖液體系下CLA轉(zhuǎn)化