人工改造豬血紅蛋白和重組松弛素受體蛋白的制備和性能.pdf

1、論文分別采用人工化學改造和基因重組改造技術手段，分別對血紅蛋白和松馳素受體蛋白這兩類功能性蛋白進行結構改造，以獲得更適于研究和應用需求的人工改造蛋白。
　　血液資源緊缺和血源性污染等問題促使人們研究和開發(fā)血液代用品，其中以血紅蛋白為基礎的血液代用品備受關注。動物血資源豐富、價廉且易于避免和控制污染，是代血物的首選原料。
　　多年來國內外研究主要集中在牛血紅蛋白為基礎的血液代用品。而豬血在我國來源廣泛，取材容易，價格低廉，且其

2、結構和性能與人血紅蛋白十分接近，免疫原性低，氧親和調節(jié)機制與人血紅蛋白相同，是人血紅蛋白的理想替代物。
　　本論文選擇豬血為原料經(jīng)分離純化制備無基質豬血紅蛋白，利用多種化學修飾手段改造豬血紅蛋白，并對修飾產物的結構、攜氧性能等進行了研究。
　　針對脫離紅細胞后的血紅蛋白容易解聚和氧親和力過高等問題，采用氧化棉子糖、雙3，5二溴水楊酸延胡索酸酯(DBBF)等小分子化合物對豬血紅蛋白進行人工修飾。SDS-PAGE分析表明，經(jīng)小分

3、子修飾后的血紅蛋白都發(fā)生了亞基間的共價交聯(lián)。
　　在脫氧狀態(tài)下，氧化開環(huán)棉子糖修飾后的豬血紅蛋白的半飽和氧分壓(P50值)為2.93kPa，希爾系數(shù)為2.1;氧解離曲線較未經(jīng)修飾的豬血紅蛋白明顯右移，有利于調整修飾產物的攜氧能力。
　　在脫氧條件下經(jīng)DBBF修飾，豬血紅蛋白攜氧能力得到改善。在反應混合物中加入IHP，產物的P50明顯升高。對DBBF修飾血紅蛋白的反應條件進行分析，發(fā)現(xiàn)當兩者摩爾濃度比為2∶1，反應時間2小時，

4、產物的P50值為3.07kPa，希爾系數(shù)為2.2。
　　聚乙二醇修飾蛋白可以增加蛋白分子量，延長其在體內循環(huán)時間，還可鈍化其免疫原性。采用4種不同方法活化PEG并對豬血紅蛋白進行修飾，比較了它們的修飾效率、修飾產物的攜氧功能和穩(wěn)定性等。
　　進一步考察采用PEG和DBBF聯(lián)合修飾豬血紅蛋白的效應。結果證明聯(lián)合修飾產物具有穩(wěn)定的四聚體結構，半飽和氧分壓P50在3.33kPa左右，接近于生理條件下人體紅細胞的P50值。
　

5、　通過檢測人工修飾產物對家兔的免疫原性，及靜脈輸注修飾產物對家兔腎、肝、心臟等重要臟器的影響，初步評價了人工改造豬血紅蛋白的生物安全性。
　　松弛素家族肽不僅是影響受精、著床、妊娠、分娩、哺乳的重要生殖激素，它還對維持心臟、血管、腎臟和腦的功能起重要作用，它可能還與某些腫瘤的發(fā)生有關。全面闡明這類激素的生物學功能及其作用機理對相關疾病的治療和藥物開發(fā)具有極其重要的意義。通過基因克隆手段表達激素受體是研究受體-配體作用機制和篩選相應

6、藥物的新思路。
　　通過基因重組手段對松弛素受體蛋白進行改造:將松弛素家族肽受體1(RXFP1)或松弛素家族肽受體2（RXFP2）的胞外域與T細胞表面抗原CD8的基因片段重組裝入質粒pcDNA3.1/zeo，后者轉染HEK293T細胞，通過篩選培養(yǎng)獲得RXFP1胞外域（即7BP）和CD8融合蛋白的表達細胞株，以及（RXFP2）胞外域（即8BP）和CD8融合蛋白的表達細胞株。經(jīng)放射性配體結合試驗表明，7BP轉染細胞表面具有與H2和H

7、3松弛素高度親和的結合位點，與報道的RXFP1特征相似;而8BP轉染細胞表面呈現(xiàn)與胰島素樣肽-3(INSL3)高度親和的結合位點，它與H2松弛素也有較高的親和性，但幾乎不結合H3松弛素，這些都符合RXFP2的特征。以上結果表明，兩種受體胞外域都已正確錨定在轉染細胞表面。
　　在受體蛋白胞外域的N端設計FLAG標簽，在胞外域蛋白與T細胞表面抗原CD8跨膜域之間設計凝血酶切割位點。穩(wěn)態(tài)轉染細胞在含5IU/ml凝血酶的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)

8、3天后，可從培養(yǎng)液中獲得從細胞表面酶切下的7BP或8BP蛋白。通過Ni螯合Sepharose和FLAG親合色譜分離純化，獲得純7BP或8BP蛋白。33P-釋放素的交聯(lián)實驗表明，可溶性純7BP保留結合松馳素的性能。純化的7BP蛋白能特異性抑制由松馳素引發(fā)細胞內cAMP水平上升的現(xiàn)象。這表明7BP是良好的RXFP1的功能拮抗物。
　　利用7BP蛋白的FLAG親和末端，將7BP固定在蛋白芯片表面，以固定化7BP蛋白芯片和SELDI-MS