丹參糖蛋白的分離純化與生物活性研究.pdf

1、丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)系鼠尾草屬植物，是一味常用中藥，以其干燥根莖入藥，可用于治療冠心病、中風(fēng)、微循環(huán)障礙等疾病。丹參中脂溶性有效成分為丹參酮類，具有抗菌作用；水溶性有效成分為酚酸類，具有抗氧化，改善心肌缺血等藥理作用。目前對(duì)于丹參活性成分的研究?jī)H限于以上兩類小分子物質(zhì)，而對(duì)于極具開(kāi)發(fā)前景的活性多糖及糖蛋白類物質(zhì)的研究報(bào)道較少。為了進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用丹參資源，本課題選取丹參為材料，采用現(xiàn)代分離分析技術(shù)對(duì)丹

2、參糖蛋白組分進(jìn)行了分離、純化，并對(duì)純化組分進(jìn)行了組成及結(jié)構(gòu)測(cè)定，采用現(xiàn)代功能評(píng)價(jià)方法對(duì)粗提物的體外抗氧化活性和對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行了初步研究，試驗(yàn)主要結(jié)論如下： 1．采用熱水浸提法提取丹參糖蛋白，正交試驗(yàn)得出最佳提取條件為：料液比1∶20、浸提溫度70℃、浸提時(shí)間4h、NaCl濃度0.1mol/L，糖蛋白得率為4.68％。 2．采用超聲輔助法提取丹參糖蛋白，正交試驗(yàn)得出最佳提取條件為：超聲功率250W、超聲處理20

3、min、NaCl濃度0.05mol/L料液比為1∶20，糖蛋白得率為6.89％。 3．丹參糖蛋白精制的最佳條件為：Sevage法去除游離蛋白7次，80％的乙醇沉淀，糖蛋白得率為5.03％。 4．丹參糖蛋白精制品為(CSGP)糖含量51.24％，蛋白質(zhì)含量37.34％的不含淀粉、還原糖、多酚類物質(zhì)的酸性物質(zhì)，利用氣相色譜法、氨基酸自動(dòng)分析儀、紫外光譜法、紅外光譜法對(duì)該提取物的單糖、氨基酸組成、光譜學(xué)特征進(jìn)行了研究，結(jié)果表明

4、該提取物含有17種已測(cè)定的氨基酸和8種單糖，存在大量的O-糖肽鍵，初步獲得了該提取物的光譜學(xué)特征圖譜。 5．丹參糖蛋白精制品(CSGP)經(jīng)DEAE-52離子交換纖維素柱層析和SephadexG．200凝膠柱層析分離出CSGP-1-a、CSGP-1-b、CSGP-3′、CSGP-4′四種組分，其純度鑒定分別采用瓊脂糖凝膠電泳和Sepharose CL-6B凝膠柱層析法，結(jié)果表明四種組分均為均一組分。 6．氣相色譜、紫外光譜

5、、紅外光譜、理化特性分析結(jié)果表明，CSGP-1-a糖含量為95.4％，α、β糖苷鍵同時(shí)存在，是主要由葡萄糖組成的硫酸化多糖，分子量87.6kD，比旋光度+52.3°；CSGP.1-b、CSGP-3′、CSGP-4′均是酸性糖蛋白，糖含量分別為89.5％，79.3％，92.5％，蛋白質(zhì)含量分別為2.5％、19.6％，7.9％；分子量分別為65.4kD、55.8kD、42.3kD，比旋光度分別為+89.6°、+132.5°、+99.5，在三

6、種組分中葡萄糖、半乳糖含量均較高，且均存在O-糖肽鍵；其中CSGP-3′、CSGP-4′含有少量磺酸基和硫酸基。 7．氨基酸分析結(jié)果表明，除CSGP-1-a未檢測(cè)出氨基酸外，CSGP-1-b、CSGP-3′、CSGP-4′均含有所測(cè)定的17種氨基酸，其中天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸含量均較高，構(gòu)成植物糖蛋白O-糖肽鍵的絲氨酸、酪氨酸含量也較高。 8．丹參糖蛋白(CSGP)對(duì)NADH/PMS體系產(chǎn)生的超氧陰離

7、子自由基，對(duì)Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生的羥基自由基均有顯著的清除作用，并呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，對(duì)DPPH自由基具有一定的清除作用，無(wú)明顯劑量效應(yīng)關(guān)系；其中對(duì)超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除率與同濃度Vc相當(dāng)。 9．丹參糖蛋(CSGP)的乙醇分級(jí)組分CSGP-A、CSGP-B、CSGP-C對(duì)超氧陰離子自由基、羥基自由基均有不同程度的清除作用，以半數(shù)清除率濃度(IC<,50>)進(jìn)行比較，對(duì)兩種自由基的清除能力的強(qiáng)弱順序均為：CSGP

8、-A>CSGP>CSGP-B>CSGP-C，其中CSGP-A組分對(duì)自由基的清除效果最好，對(duì)·OH和O<,2><'->·的半數(shù)清除率濃度分別為0.0970 mg·mL<'-1>和0.0716 mg·mL<'-1>，是CSGP中抗氧化的強(qiáng)效組分。 10．通過(guò)建立環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠模型來(lái)考察丹參糖蛋白(CSGP)的免疫調(diào)節(jié)功能，結(jié)果表明丹參糖蛋白能刺激免疫抑制小鼠免疫器官的增長(zhǎng)(P<0.01)，增強(qiáng)免疫抑制小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬雞紅