高鐵肌紅蛋白還原酶分離純化及表征.pdf

1、本文是以新鮮豬心肌為實(shí)驗(yàn)肉樣，通過對(duì)現(xiàn)有動(dòng)物蛋白分離純化技術(shù)的改進(jìn)，建立高鐵肌紅蛋白還原酶純化方法和技術(shù)參數(shù)，獲得高鐵肌紅蛋白還原酶生物樣品。
　　 并基于獲得高鐵肌紅蛋白還原酶生物樣品，對(duì)高鐵肌紅蛋白還原酶理化特性進(jìn)行研究，解釋高鐵肌紅蛋白還原酶(MetMbR)與高鐵肌紅蛋白(MetMb)互作關(guān)系。結(jié)果與結(jié)論如下：
　　 1 高鐵肌紅蛋白還原酶的分離、純化及鑒定以新鮮豬心肌為材料，經(jīng)過勻漿、硫酸銨分級(jí)沉淀及透析后，采用

2、陰、陽離子交換層析及親和層析等分離純化技術(shù)并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，經(jīng)SDS-PAGE和PAGE 電泳得到單條蛋白帶，初步證實(shí)該條帶為單亞基蛋白，分子量約為46KD；進(jìn)一步光譜掃描，該蛋白帶具有MetMbR活性，確定為該純化的蛋白為MetMbR。豬心肌MetMbR 最終得率可達(dá)到1.94％，其比活力達(dá)到284.5U/mg，并獲得電泳純的MetMbR。本實(shí)驗(yàn)建立的豬心肌分離純化MetMbR 工藝條件相對(duì)便捷、分離純化成本低，可用于規(guī)?；a(chǎn)MetM

3、bR。
　　 2 豬心肌高鐵肌紅蛋白還原酶動(dòng)力學(xué)研究以馬心肌MetMb 為參照，研究豬心肌提取液中MetMbR在豬MetMb 存在條件下酶活性的表達(dá)，及MetMbR 米氏方程建立和動(dòng)力學(xué)特征的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，影響MetMbR活性表達(dá)的主要因素有pH 值、反應(yīng)時(shí)間和溫度等。當(dāng)反應(yīng)體系中底物濃度與酶液體積一定時(shí)，MetMbR 最佳反應(yīng)條件為pH6.4（p<0.01)、溫度35℃
　　 （p<0.05)和時(shí)間30min（p

4、<0.05)。豬心肌MetMb 為底物時(shí)，MetMbR 米氏方程Y 豬=0.0004x+0.0083(R2=0.9948)，Km 4.82×10-5 M，Vmax 120.48 n mol min-1g-1。研究還表明，體外條件下，當(dāng)pH<6.0 或pH>7.0 時(shí)，MetMbR的活性逐漸降低；低溫時(shí)酶活性表達(dá)明顯受抑制；隨溫度升高到20℃后，該酶活性高表達(dá)；但溫度超過50℃時(shí)，酶失活。
　　 3 胞外高鐵肌紅蛋白還原酶電子傳遞

5、活性位點(diǎn)的研究以NADH 為反應(yīng)體系的啟動(dòng)劑，研究豬心肌提取液中MetMbR活性的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)酶活性的表達(dá)依賴NADH 啟動(dòng)，且0.2mM NADH 濃度可充分啟動(dòng)MetMbR活性的表達(dá)。研究還表明，ATP 可全程抑制MetMbR 呼吸鏈電子的傳遞，抑制酶的活性；NaN3 通過阻斷呼吸鏈第三位點(diǎn)電子傳遞來抑制酶活性的表達(dá)；而N-Ethylmaleimide能與MetMbR 官能團(tuán)巰基（-SH）瞬間結(jié)合并快速使酶活性喪失；