化濁解毒方中藥血清對肝星狀細胞ERK及PI3K-Akt信號通路的影響.pdf

1、目的:肝星狀細胞(HSC)的激活與活化是肝纖維化發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)，細胞外基質(ECM)合成與降解失衡是肝纖維化形成的主要病理過程。肝纖維化是由于多種致病因素引起的肝細胞的損傷及肝組織的炎癥反應，是各種慢性肝病發(fā)展成為肝硬化的病理基礎。目前臨床尚缺乏特效、無毒副作用的抗肝纖維化藥物，而中醫(yī)藥以整體調節(jié)為出發(fā)點，以辨證論治為指導，在抗肝纖維化方面具有獨特的療效和優(yōu)勢。導師李佃貴教授以“濁毒”理論治療多種原因引發(fā)的肝纖維化，認為濁毒內(nèi)蘊、肝絡瘀

2、阻是肝纖維化的基本病機，采用“化濁、解毒、調肝”為組方原則，制定了化濁解毒方，并取得較好的療效。本實驗采用血清藥理學方法，從細胞水平觀察MMP13和TIMP1mRNA、ERK、PI3K及Akt蛋白的表達，探討化濁解毒方大鼠含藥血清對ECM及HSC活化相關的信號轉導通路的作用，為化濁解毒方抗肝纖維化可能的作用機制提供實驗依據(jù)。
　　 方法:選取清潔級雄性SD大鼠40只，體重（200±20）g。自適應喂養(yǎng)一周后，隨機分為模型對照組（

3、給予生理鹽水）、陽性對照組（即復方鱉甲軟肝片組）、化濁解毒方組（分為臨床等效劑量和二倍等效劑量），各組等體積灌胃給予相應藥物10天后，制備大鼠含藥血清。以含藥血清體外培養(yǎng)肝星狀細胞并加入TGF-β1，培養(yǎng)48h;其中，每只模型對照組大鼠同時留取備份血清，培養(yǎng)原代的肝星狀細胞48h，作為正常對照組。應用RT-PCR法檢測HSC中MMP13及TIMP1mRNA的表達，Western-blot法檢測p-ERK、PI3K及p-Akt蛋白的表達。

4、
　　 結果:
　　 1、RT-PCR法檢測HSC中MMP13及TIMP1mRNA的表達:
　　 1.1、MMP13mRNA的表達:與正常對照組比較，模型對照組、陽性對照組、化濁解毒方臨床等效劑量及二倍等效劑量組中MMP13mRNA的表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與模型對照組比較，陽性對照組、化濁解毒方二倍劑量組均可促進MMP13mRNA的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);化濁解毒方二倍等效

5、劑量的促進作用優(yōu)于臨床等效劑量，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 1.2、TIMP1mRNA的表達:與正常對照組比較，給予TGFβ-1干預的各受試組TIMP1mRNA的表達均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其余各組間差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 2、Western-blot法檢測HSC中p-ERK、PI3K、p-Akt蛋白表達:
　　 2.1、p-ERK蛋白的表達:與正常對照

6、組比較，模型對照組、陽性對照組、化濁解毒方臨床等效劑量及二倍等效劑量組p-ERK蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。陽性對照組、化濁解毒方二倍等效劑量組p-ERK蛋白表達均低于模型對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)?；瘽峤舛痉蕉兜刃┝拷Mp-ERK蛋白表達低于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)?；瘽峤舛痉蕉兜刃┝拷Mp-ERK蛋白表達低于化濁解毒方臨床等效劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

7、　　 2.2、PI3K蛋白的表達:模型對照組、陽性對照組、化濁解毒方臨床等效劑量及二倍等效劑量組與正常對照組比較，PI3K蛋白表達均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與模型對照組比較，化濁解毒方二倍等效劑量組PI3K蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;化濁解毒方二倍等效劑量與陽性對照組比較PI3K蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);化濁解毒方二倍等效劑量組PI3K蛋白表達低于化濁解毒方臨床等效劑量組，差異

8、有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2.3、p-Akt蛋白的表達:與正常對照組比較，模型對照組p-Akt蛋白的表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），化濁解毒方二倍等效劑量組p-Akt蛋白的表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;陽性對照組、化濁解毒方臨床等效劑量及二倍等效劑量組p-Akt蛋白表達均較模型對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其中化濁解毒方二倍等效劑量組差異有顯著性(P＜0.01);化濁解毒方二

9、倍等效劑量與臨床等效劑量比較，p-Akt蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1、化濁解毒方含藥血清可通過改善HSC中受抑制的MMP13表達，促進ECM降解，進而改善ECM的沉積。
　　 2、化濁解毒方含藥血清可能通過降低HSC中p-ERK、PI3K、p-Akt蛋白的表達，進而阻斷ERK及PI3K/Akt信號轉導通路，起到減輕HSC活化程度的作用。
　　 3、化濁解毒方