缺血缺氧性視神經(jīng)視網(wǎng)膜損傷的分子機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 Homer1a在眼部缺血缺氧損傷中的作用
　　1研究背景：
　　眼部缺血缺氧后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生病理改變，可引起視神經(jīng)不可逆的損傷，導(dǎo)致視力損失甚至失明。目前研究發(fā)現(xiàn)，眼部缺血缺氧損傷主要發(fā)生在視網(wǎng)膜動(dòng)靜脈阻塞、未成熟的視網(wǎng)膜病變、糖尿病性的視網(wǎng)膜病變、青光眼等視網(wǎng)膜血管阻塞所致的缺血性疾病中，表現(xiàn)為組織細(xì)胞缺血及缺氧損傷后，細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)消失、功能破壞等。因此，保護(hù)視神經(jīng)、減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺血缺氧后損傷等研究

2、具有重要的意義和作用。前期文獻(xiàn)報(bào)道提示，Homer1a作為一種重要的突觸后致密物質(zhì)，在創(chuàng)傷性腦損傷中具有重要作用，可通過調(diào)節(jié) Erk信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。也有研究發(fā)現(xiàn)Homer1和眼部疾病密切相關(guān)，但在眼部缺血缺氧損傷后Homer1a的改變與作用尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。本研究的目的是：（1）明確眼部缺血缺氧后Homer1a的表達(dá)變化；（2）探討在眼部缺血缺氧后Homer1a對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用及其機(jī)制。
　　2方法：

3、r>　?。?）細(xì)胞模型：原代培養(yǎng)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，采用氧糖剝奪模型；（2）動(dòng)物模型：生理鹽水誘導(dǎo)小鼠眼部缺血缺氧模型；（3）蛋白表達(dá)：采用Western blot檢測(cè)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或視網(wǎng)膜中Homer1a、Erk、磷酸化Erk（p-Erk）、剪切的Caspase3（cleaved-Caspase3）、Caspase3等蛋白在缺血缺氧后的表達(dá)變化；（4）細(xì)胞損傷：TUNEL染色及 Caspase3剪切水平檢測(cè)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡情況

4、，β-III-微管蛋白染色檢測(cè)視網(wǎng)膜缺血缺氧后的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活情況；（5）藥物干預(yù)：應(yīng)用Erk抑制劑（PD98059）抑制 Erk激活；（6）基因干涉/過表達(dá)：采用慢病毒介導(dǎo)的基因干涉/過表達(dá)手段調(diào)節(jié)Homer1a表達(dá)；（7）基因敲除動(dòng)物：采用Homer1a基因敲除動(dòng)物驗(yàn)證Homer1a神經(jīng)保護(hù)作用。
　　3結(jié)果和結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)分別使用細(xì)胞及動(dòng)物缺血缺氧模型，通過Western blot、基因干涉/過表達(dá)、TUNE

5、L染色、基因敲除等方法，研究Homer1a在眼部缺血缺氧損傷中的表達(dá)改變、作用及其機(jī)制。我們的研究發(fā)現(xiàn)，體外視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞氧糖剝奪或體內(nèi)眼部缺血缺氧損傷后，Homer1a及p-Erk表達(dá)水平均顯著升高。在體外實(shí)驗(yàn)中，上調(diào)Homer1a后，p-Erk表達(dá)水平顯著下降，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡率明顯降低；而下調(diào)Homer1a蛋白，p-Erk表達(dá)水平升高，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率也增高。此外，抑制Erk活性，Home1a表達(dá)明顯增加，視網(wǎng)膜神經(jīng)

6、節(jié)細(xì)胞凋亡率明顯下降。以上實(shí)驗(yàn)表明，氧糖剝奪損傷后，Homer1a可保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；在相同損傷條件下，p-Erk表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率有相關(guān)關(guān)系，高表達(dá) p-Erk視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率升高，而低表達(dá)p-Erk視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率降低；Homer1a與Erk信號(hào)通路相互作用，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明：小鼠眼部缺血缺氧造模后，Homer1a基因敲除小鼠（KO，Homer1a-/-）視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活率及突起連接較野生

7、型小鼠（WT，Homer1a+/+）顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)視網(wǎng)膜缺血缺氧損傷后 Homer1a可能有神經(jīng)保護(hù)作用。綜上，在眼部缺血缺氧損傷中Homer1a可能通過調(diào)節(jié)Erk信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分 NLRP3炎性體在眼部缺血缺氧損傷中的作用
　　1研究背景：
　　眼部缺血缺氧可導(dǎo)致眼底部神經(jīng)組織不可逆損傷，該種損傷存在于多種眼部疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中。近期研究表明，眼部的缺血缺氧損傷最早發(fā)生在視乳頭區(qū)，眾

8、所周知，視乳頭區(qū)是視神經(jīng)出眼入顱的部位，該部位視神經(jīng)可直接和小膠質(zhì)細(xì)胞接觸，當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞受刺激被激活后，可迅速釋放炎性因子等，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引起細(xì)胞組織損傷。我們的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在小鼠和人的視網(wǎng)膜乳頭區(qū)NLRP3炎性體高表達(dá)。NLRP3炎性體作為Caspase1激活的平臺(tái)，在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中具有重要作用。但NLRP3炎性體激活并導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的具體機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。本研究的目的是：(1)明確NLRP3炎性體在眼部缺

9、血缺氧損傷中的改變與作用；(2)探討NLRP3炎性體在眼部缺血缺氧損傷后的確切作用機(jī)制。
　　2方法：
　?。?）動(dòng)物模型：聚苯乙烯微球前房注射誘導(dǎo)小鼠眼部缺血缺氧模型；（2）免疫熒光染色：β-Ⅲ-微管蛋白標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及 Iba1染色標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞；（3）分子表達(dá)：采用熒光實(shí)時(shí)定量的方法檢測(cè)動(dòng)物視網(wǎng)膜乳頭區(qū)組織中炎性體相關(guān)蛋白在缺血缺氧后的表達(dá)變化。
　　3結(jié)果和結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)使用聚苯乙烯微球前房注射

10、誘導(dǎo)小鼠眼部缺血缺氧模型，通過免疫熒光染色、熒光實(shí)時(shí)定量等方法，研究NLRP3炎性體在眼部缺血缺氧損傷中的作用及機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性體在正常人及小鼠視網(wǎng)膜乳頭區(qū)均高表達(dá)。小鼠眼部缺血缺氧損傷后，NLRP3敲除小鼠（KO，NLRP3-/-）及ASC敲除小鼠（KO，ASC-/-）視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活率及突起連接較野生型小鼠（C57/BL6J）顯著增加，證實(shí)視網(wǎng)膜缺血缺氧損傷后NLRP3炎性體可能在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷中起重要作用

11、。進(jìn)一步熒光實(shí)時(shí)定量方法發(fā)現(xiàn)，眼部缺血缺氧損傷后，野生型小鼠（C57/BL6J）視網(wǎng)膜乳頭區(qū)NLRP3炎性體相關(guān)分子Caspase1、IL-1β和IL-18表達(dá)顯著升高。以上結(jié)果證明，NLRP3炎性體在小鼠眼部缺血缺氧損傷中，活化小鼠視乳頭區(qū)Caspase1、IL-1β和IL-18等炎性因子。此外，IL-1R敲除小鼠（KO，IL-1R-/-）及IL-18敲除小鼠（IL-18-/-）眼部缺血缺氧損傷后，較野生型小鼠（C57/BL6J），其