斑馬魚視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜中再生相關(guān)miRNAs的鑒定與分析.pdf

1、miRNA作為一類可以在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)水平的非編碼RNA大家族的重要小分子，從被發(fā)現(xiàn)后，經(jīng)過(guò)數(shù)年的探索，逐漸為人們所了解。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA在不同的神經(jīng)生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞增殖，生長(zhǎng)，分化，凋亡，和神經(jīng)活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。miRNA在神經(jīng)調(diào)節(jié)中的功能和作用已經(jīng)被人們?cè)谠S多方面所認(rèn)識(shí)，已被發(fā)現(xiàn)與大量中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)聯(lián)。研究表明，哺乳動(dòng)物等高等動(dòng)物和人類視神經(jīng)受到損傷后其再生能力很有限，而且miRNAs的表達(dá)在中樞神經(jīng)損傷

2、再生的不同時(shí)期發(fā)生著明顯的變化。魚類和兩棲類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有再生的能力已經(jīng)被研究證明，而視神經(jīng)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，具有易于進(jìn)行試驗(yàn)處理等特點(diǎn)，因此本試驗(yàn)以斑馬魚為模型探尋視神經(jīng)損傷再生過(guò)程中相關(guān)miRNAs的表達(dá)變化以及調(diào)控功能，將會(huì)有助于了解中樞神經(jīng)損傷再生過(guò)程中miRNA的分子調(diào)控機(jī)理。
　　作為神經(jīng)病學(xué)的一個(gè)新的研究領(lǐng)域，miRNA和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系已經(jīng)引起人們的重視。根據(jù)目前研究現(xiàn)狀，為了進(jìn)一步促進(jìn)對(duì)miRNA與

3、視神經(jīng)損傷再生功能間的關(guān)系的理解，本研究構(gòu)建了斑馬魚視神經(jīng)損傷相關(guān)的A、B、C、D四個(gè)小RNA cDNA文庫(kù)（A組為對(duì)照組，B、C、D為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，其中B組為視神經(jīng)損傷1天組、C組為視神經(jīng)損傷4天組、D組為視神經(jīng)損傷7天組）。通過(guò)對(duì)四個(gè)小RNA文庫(kù)的高通量測(cè)序和后續(xù)生物信息學(xué)分析，鑒定了視神經(jīng)損傷不同時(shí)期的miRNAs。并選擇其中鑒定到的miRNAs，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR分析進(jìn)一步描述了它們?cè)趽p傷不同階段的表達(dá)譜，從而以豐度表達(dá)差異變化闡

4、述了miRNA與神經(jīng)損傷修復(fù)之間的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:
　　1.在四個(gè)sRNA文庫(kù)A、B、C和D組中分別鑒定得到17,839,945、15,607,126、15398526和16771780條原始序列。除去低質(zhì)量讀數(shù)、接頭序列、污染等后，四個(gè)文庫(kù)中高質(zhì)量讀數(shù)序列分別占原始讀數(shù)的98.74％、98.94%、98.94%和98.87%。另外，在高質(zhì)量讀數(shù)中，A、B、C和D組四個(gè)文庫(kù)中大于等于17nt的純凈序列讀數(shù)分別占66.51%

5、、75.37%、73.66%、72.72%。
　　2.與斑馬魚miRNA成熟體序列對(duì)比，在四個(gè)文庫(kù)中共鑒定到204種保守的miRNAs，在A、B、C和D組庫(kù)中分別被鑒定到193、199、196、199種保守的斑馬魚miRNA，對(duì)其分析，其中189種為四個(gè)文庫(kù)中共有的，分別有3、1、2種僅在A、B和C組中存在，在A和B組、A和C組、A和D組、C和D組之間各有1種共存，2種在A、B和C組中存在，1種在A、B和D組中存在，2種在A、C和

6、D組中存在。
　　3.通過(guò)Mireap軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，在四個(gè)sRNA文庫(kù)中共發(fā)現(xiàn)23種新的miRNAs。其中有七種在四個(gè)文庫(kù)中都有表達(dá)，四種只在對(duì)照組A組中表達(dá)，三種只在B組中表達(dá)，一種只在C組中表達(dá)，一種只在D組中表達(dá)。兩種在A、C和D組中表達(dá)，而其他四種miRNAs分別以不同的組合在不同時(shí)期表達(dá)。
　　4.在四個(gè)文庫(kù)中鑒定的成熟的miRNAs中，它們各自在文庫(kù)中的表達(dá)量不同，一些miRNAs的表達(dá)量在文庫(kù)中占有明顯的優(yōu)勢(shì)地

7、位，不同miRNAs的豐度存在較大差異，其變化從稀有miRNAs的幾個(gè)計(jì)數(shù)到最豐富miRNAs的幾百萬(wàn)讀數(shù)，例如，miR-21、miR-22和miR-99呈現(xiàn)超過(guò)150000的高豐度表達(dá)，而miR-124、miR-129、miR-184、miR-203和miR-738的Reads僅在10000以上，miR-132、miR-15、miR-206、miR-7和miR-92的Reads卻只有幾千。選擇部分miRNAs用實(shí)時(shí)定量PCR做進(jìn)一步驗(yàn)

8、證，結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果和高通量測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致。
　　5.對(duì)四個(gè)文庫(kù)中表達(dá)的已知miRNAs的差異表達(dá)進(jìn)行篩選，A和B組兩個(gè)文庫(kù)中有48個(gè)miRNAs的表達(dá)出現(xiàn)了差異，A和C組中共有47個(gè)miRNAs的表達(dá)出現(xiàn)了差異，A和D組中共有55個(gè)miRNAs的表達(dá)出現(xiàn)了差異，B和C組中共有43個(gè)表達(dá)差異的miRNAs，B和D組中共有37個(gè)表達(dá)差異的miRNAs，C和D組中共有42個(gè)表達(dá)差異的miRNAs。
　　6.對(duì)照斑