ATD致粒細胞缺乏骨髓象及相關(guān)miRNA的初步研究.pdf

1、第一部分，ATD導致粒細胞缺乏患者骨髓特點分析
　　目的：分析抗甲狀腺藥物（Antithyroid drug, ATD）治療導致粒細胞缺乏癥患者骨髓象特點及相關(guān)臨床資料，探索骨髓象特點與粒細胞恢復情況及臨床預后的關(guān)系。
　　方法：檢索2008年1月～2011年12月南華大學附屬第一醫(yī)院、南華大學附屬郴州醫(yī)院、南華大學附屬第二醫(yī)院血液科及內(nèi)分泌科收治的有完整診療過程記錄及骨髓檢查結(jié)果的住院病歷,骨髓涂片提示取材不理想的病例予以

2、剔除。確定33例為本研究的對象?？偨Y(jié)分析其骨髓象特點、粒細胞恢復時間、熱程長短等指標。
　　結(jié)果：ATD導致粒細胞缺乏患者骨髓特點可以分為粒系成熟障礙型及粒系再生障礙型兩類。33例粒缺患者中骨髓象為成熟障礙型13例(39.4％)、再生障礙型20例(60.6%)，再生障礙型組骨髓增生活躍15例，增生減低5例。成熟障礙型組骨髓增生明顯活躍3例，增生活躍10例。成熟障礙型患者粒細胞上升至正常平均（4.7±1.0）天，而再生障礙型為（8.

3、0±2.8）天,兩組比較差異有顯著性（P＜0.01），發(fā)熱天數(shù)在成熟障礙型組為（3.6±2.5）天，再生障礙型組為（8.6±3.1）天，成熟障礙型組熱程明顯短于再生障礙型組（P＜0.01），2例死亡患者骨髓檢查為再生障礙型。
　　結(jié)論：1、ATD導致粒細胞缺乏患者骨髓象可以分為粒系再生障礙型和成熟障礙型兩類，以粒系再生障礙型為主。2、骨髓象為成熟障礙型患者較再生障礙型患者粒細胞恢復快，發(fā)熱時間短，預后好。
　　第二部分，AT

4、D導致粒細胞缺乏患者血漿差異表達miRNA的篩選及鑒定
　　目的：研究 ATD導致粒細胞缺乏患者粒細胞缺乏時及粒細胞恢復正常后血漿miRNA表達譜的變化。
　　方法：選取年齡、性別、服用ATD類別及療程基本匹配的5名ATD導致粒細胞缺乏患者，抽取粒細胞缺乏時及粒細胞恢復正常1周后的外周靜脈血各2ml，分離血漿提取總RNA，應用Agilent human miRNA(8*60K) V16.0芯片分析粒細胞缺乏時及粒細胞恢復正常

5、后 miRNA表達譜的差異。生物信息學分析表達差異明顯的miRNA的靶基因及功能。qRT-PCR驗證低表達hsa-miR-20a、hsa-miR-223、hsa-miR-106b、hsa-miR-19b在ATD導致粒細胞缺乏時及粒細胞恢復正常后及服用ATD3月以上未出現(xiàn)粒細胞減少患者血漿中的表達情況。結(jié)合患者臨床資料，分析 hsa-miR-20a、hsa-miR-223、hsa-miR-106b、hsa-miR-19b表達變化與患者服用

6、ATD類別及骨髓特點分類的關(guān)系。
　　結(jié)果：通過對芯片進行圖像掃描和數(shù)據(jù)分析，篩選獲得32個ATD導致粒細胞缺乏相關(guān)miRNA，其中9個表達上調(diào)(Fold change,FC≥2)，23個表達下調(diào)（FC≤0.5）；顯著上調(diào)的有hsa-miR-200、hsa-miR-756、hsa-miR-320a、hsa-miR-21、hsa-miR-30a、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320e(FC≥5)，顯著下調(diào)的有hsa-

7、miR-20a、hsa-miR-223、hsa-miR-106b、hsa-miR-19b、hsa-miR-1234、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-15a、hsa-miR-197、hsa-miR-144（FC≤0.2）。生物信息學分析提示低表達的miRNA與細胞凋亡及細胞周期調(diào)控密切相關(guān)，高表達miRNA多參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞增殖、炎癥反應等過程。進一步對低表達hsa-miR-20a、hsa-miR-223、hsa-mi

8、R-106b、hsa-miR-19b的qRT-PCR驗證，證實了芯片結(jié)果可靠。qRT-PCR驗證的4個miRNA表達變化在服用MMI和PTU兩組患者間無明顯差異（p＞0.05）。且4個低表達miRNA在骨髓分類為粒系再生障礙型和粒系成熟障礙型兩組患者間差異不明顯（p＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、通過miRNA芯片篩選及qRT-PCR檢測，成功獲得ATD導致粒細胞缺乏發(fā)生相關(guān)的血漿miRNA譜。
　　2、ATD致粒

9、細胞缺乏的miRNA表達變化與服用ATD類別及骨髓特點分類無明顯相關(guān)。
　　3、粒細胞缺乏時差異低表達的hsa-miR-20a、hsa-miR-223、hsa-miR-106b、hsa-miR-19b等均與細胞凋亡相關(guān)，提示粒細胞凋亡增加可能是ATD致粒細胞缺乏發(fā)生的原因。
　　第三部分，Hsa-miR-20a對HL-60、U-937細胞生物學性狀的影響
　　目的：選取miRNA芯片篩選獲得的顯著低表達的hsa-miR

10、-20a作為研究對象，觀察hsa-miR-20a表達變化對HL-60、U-937細胞生物學性狀的影響。
　　方法：構(gòu)建hsa-miR-20a低表達及高表達慢病毒載體，感染293T細胞，采用熒光檢測法測定病毒的滴度。復蘇培養(yǎng)HL-60、U-937細胞，實驗分為三組：hsa-miR-20a高表達組（hsa-miR-20a up）、hsa-miR-20a低表達組（hsa-miR-20a down）、空載體對照轉(zhuǎn)染組（control）。取

11、對數(shù)生長期細胞根據(jù)病毒滴度及MOI值加入慢病毒感染，分別于感染后48h、72h鏡下觀察細胞形態(tài)改變，MTT及FCM檢測各組細胞增殖及凋亡的情況。qRT-PCR檢測各組細胞hsa-miR-20a表達變化情況。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建低表達及高表達hsa-miR-20a的慢病毒載體，hsa-miR-20a up慢病毒滴度為4×108TU/ml, hsa-miR-20a down慢病毒滴度為8×108TU/ml。兩組病毒成功感染HL-60、

12、U-937細胞，qRT-PCR證實了感染后各組細胞hsa-miR-20a表達水平的變化，低表達hsa-miR-20a可以抑制HL-60、U-937細胞生長，促進其凋亡。而且， hsa-miR-20a低表達對HL-60細胞生長抑制及凋亡促進作用較U-937細胞更加明顯（p＜0.05）。高表達hsa-miR-20a對兩組細胞生長增殖及凋亡的影響與對照組無明顯差異（p＞0.05）。
　　結(jié)論：Hsa-miR-20a低表達及高表達慢病毒載

13、體可以在HL-60、U-937細胞中實現(xiàn) hsa-miR-20a的低表達及高表達變化。Hsa-miR-20a低表達可抑制 HL-60、U-937細胞生長，促進其凋亡。其對HL-60細胞生長抑制及凋亡促進作用較 U-937細胞更加明顯。
　　第四部分，Hsa-miR-20a調(diào)控粒細胞凋亡的機制研究
　　目的：探索hsa-miR-20a調(diào)控HL-60細胞凋亡的靶向基因及其作用機制。
　　方法：生物信息學軟件在線分析hsa-

14、miR-20a的種子序列，與細胞凋亡相關(guān)的靶向基因及其3’UTR作用位點，位點結(jié)合自由能等生物信息。選取可能的靶向作用位點構(gòu)建雙熒光素酶報告基因載體，檢測軟件預測位點的有效性。RT-PCR及Western-blot檢測hsa-miR-20a表達變化對靶向基因mRNA及蛋白表達的影響。并采用Western-blot檢測靶向蛋白的下游調(diào)控蛋白表達水平變化情況。免疫組化檢測ATD導致粒細胞缺乏患者骨髓粒細胞中相應靶向蛋白的表達情況。
　

15、　結(jié)果：多生物信息學軟件預測均發(fā)現(xiàn)hsa-miR-20a與PTEN3’UTR有很好的作用位點及結(jié)合自由能。雙熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 hsa-miR-20a高表達能使psiCHECK?-2-PTEN-WT3’UTR質(zhì)粒的表達水平顯著下降，而對psiCHECK?-2-PTEN-Mut3’UTR質(zhì)粒的表達無影響。RT-PCR檢測PTEN mRNA水平變化發(fā)現(xiàn)與對照組比較，hsa-miR-20a up能顯著下調(diào)PTEN mRNA水平。We

16、stern-blot檢測結(jié)果顯示隨著hsa-miR-20a表達的下降，HL-60細胞中PTEN蛋白的表達量較對照組顯著上調(diào)，而PTEN下游調(diào)控蛋白p-Akt、Bcl-2表達水平下降，Bax表達升高。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)粒系成熟障礙型患者骨髓粒細胞 PTEN蛋白表達量較正常骨髓象有增加。
　　結(jié)論：PTEN是 hsa-miR-20a調(diào)控粒細胞凋亡的靶向基因，PTEN通過影響線粒體凋亡信號p-Akt/Bcl-2/Bax通路在ATD導致粒細