PRL-3上調(diào)VEGF、VEGF-C表達并與肺癌的MVD、LVD呈正相關.pdf

1、中國醫(yī)科大學碩士學位論文PRL3上調(diào)VEGF、VEGFC表達并與肺癌的MVD、LVD呈正相關姓名：陶娟申請學位級別：碩士專業(yè)：病理學與病理生理學指導教師：邱雪杉20090401％C02條件下培養(yǎng)。待細胞至對數(shù)生長期呈單層亞融合狀態(tài)，加入含不同處理因素的培養(yǎng)液，在不同時間點收取細胞。2、方法21WesternBlot法：在收集的細胞或組織內(nèi)加入裂解液充分裂解，低溫高速離心，提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60ug。電泳(12％SDSPAGE

2、凝膠)、轉(zhuǎn)印(50V，120min)、5％正常小牛血清封閉，一抗ERKl／2(1：200)、PERK(1：200)，13actin(1：200)，VEGF(1：100)、VEGFC(1：200)，4“C孵育過夜，分別與各自對應的二抗(1：2500，chemicon，USA)室溫孵育2h，DAB顯色，結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀(ChemiImager5500，AlphaInnotechUSA)采集，進行灰度值測定。22細胞遷移和侵襲能力

3、檢測在transwell小室(Corning公司)下室加入600ul含10％d、牛血清DMEM培養(yǎng)基，上室中加入100ul無血清DMEM培養(yǎng)基，接種A549細胞數(shù)為25104個。37“C、5％C0。孵箱中培養(yǎng)6hr后吸盡培養(yǎng)基，PBS清洗后，甲醇室溫固定15min，用棉簽輕擦掉微孔膜上表面的細胞，蘇木素染色，室溫干燥過夜。取下微孔膜，置載玻片上，鏡下觀察。細胞侵襲能力的測定用預冷的無血清培養(yǎng)基以1：7稀釋Matrigel(BDBiose

4、iences，USA)加入上室100ul，在室溫下放置6h。使用前用培養(yǎng)基重新水化并吸凈，其他與遷移實驗相同，培養(yǎng)18hr后觀察結(jié)果。23逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈式反應(RT—PCR)：提取細胞總RNA，按RTPCR(TaKaRa)試劑盒方法進行反應。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進行半定量分析。24MTT法測定細胞增殖率的變化，以不含細胞的等體積培養(yǎng)基作對照，重復3次，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。流式細胞儀檢測細胞凋亡率，重