構(gòu)建雙熒光可視化TGF-β誘導(dǎo)的EMT的細胞模型.pdf

1、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮細胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學(xué)過程，表現(xiàn)為上皮細胞失去自身的特點，并獲得間充質(zhì)特性。EMT在胚胎發(fā)育、組織重建、慢性炎癥、細胞獲得干性、多種纖維化疾病和癌癥轉(zhuǎn)移中都發(fā)揮了重要作用。其中，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growthfactorβ，TGF-β)是誘導(dǎo)EMT的重要因子。
　　由于EMT在正常生理活動以及疾病

2、發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，快速的篩選EMT相關(guān)分子藥物具有顯著地意義和應(yīng)用價值。本文介紹了我們利用EMT相關(guān)標志物，通過構(gòu)建E-cadherin和Vimentin啟動子報告熒光質(zhì)粒從而成功建立了快速指示EMT的可視化工具。已知E-cadherin的消失和Vimentin的上調(diào)是EMT的最為突出的變化，我們構(gòu)建了E-cadherin啟動子(-1000-+125bp)驅(qū)動的GFP報告質(zhì)粒(E-cad-GFP)和Vimentin啟動子(-10

3、27-+1121bp)驅(qū)動的RFP報告質(zhì)粒(Vim-RFP)。我們將這兩種熒光質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人乳腺上皮細胞MCF10A，之后我們分別挑取了兩個穩(wěn)定表達E-cad-GFP的單克隆M6和13G以及兩個穩(wěn)定表達Vim-RFP的單克隆ZB1和ZB101，這四個單克隆都良好的響應(yīng)TGF-β刺激介導(dǎo)的EMT過程并發(fā)生相應(yīng)的熒光改變。此后我們將這四株細胞兩兩組合，從中我們得到最好的兩個混合細胞M6+ZB1和13G+ZB101。在細胞處于正常上皮形態(tài)時E

4、-cadherin介導(dǎo)的綠色熒光明顯顯示，而vimentin介導(dǎo)的紅色熒光并不明顯，但當細胞在受到TGF-β刺激48小時后，細胞發(fā)生了明顯的EMT變化，此時細胞中的綠色熒光明顯降低，相反的紅色熒光明顯增強。根據(jù)以上結(jié)果我們認為這兩種熒光的表達可隨這兩種EMT標志物的啟動子的變化靈敏改變。在隨后的試驗中我們更證實了這兩株混合細胞可以響應(yīng)除TGF-β刺激外其他細胞因子TNF-α、VEGF、EGF、PDGF-BB的刺激，由此我們認定該細胞模型