Gadd45b參與TGF-β誘導的足細胞損傷機制.pdf

1、局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerular sclerosis，F(xiàn)SGS)是兒童和成年人腎病綜合征的常見原因，其發(fā)病率逐年上升。FSGS患者臨床表現(xiàn)為大量蛋白尿，病理表現(xiàn)為足細胞不同程度的損傷?；颊咭撞l(fā)感染、靜脈血栓以及急性腎損傷，部分患者激素治療效果不理想，進展為終末期腎病(endstage renal disease，ESRD)。FSGS足細胞損傷機制尚不清楚。因此本研究從足細胞損傷機制入手，討論其

2、可能的損傷機制，以加深對該疾病的認識。
　　 第一部分、Gadd45b在局灶節(jié)段性腎小球硬化患者腎小球中的表達以及意義
　　 目的:Gadd45b作為DNA損傷修復的重要相關基因家族成員之一，該基因編碼的蛋白Gadd45β是一種酸性核蛋白，它參與細胞周期停滯、DNA損傷修復、細胞生存與凋亡的調(diào)節(jié)，可能參與了FSGS的足細胞損傷。觀察FSGS患者Gadd45b的表達分布，有助于加深對FSGS發(fā)病機制的認識。明確Gadd45

3、b在FSGS患者腎小球中表達的變化、定位以及與患者臨床病理指標的相關性。
　　 方法:選取成人FSGS患者37例:門周型(n=3)，細胞型(n=2)，塌陷性(n=1)，頂部型(n=1)，和經(jīng)典型(n=30)。腎切除癌旁組織(n=8)作為對照。實時定量RT-PCR檢測FSGS患者腎小球Gadd45b基因表達的變化。免疫組化法分析腎組織Gadd45β的表達強度與分布。免疫熒光行腎組織Gadd45β和synaptodin、WT-1雙套

4、染，并采用膠體金免疫電鏡技術明確Gadd45β在腎小球中的定位。用累積光密度(IOD)來計算FSGS患者腎小球Gadd45β的表達強度，并分析其與臨床病理指標的相關性。
　　 結果:
　　 (1)實時定量RT-PCR結果顯示FSGS患者腎小球Gadd45b基因表達顯著高于正常組對照組(p＜0.05)。
　　 (2)正常對照組腎小球Gadd45β弱陽性。免疫組化半定量結果顯示，F(xiàn)SGS患者Gadd45β表達顯著高于

5、正常對照組(FSGS的IOD:3807.20±2069.80 vs正常對照組的IOD:979.08±202.82，p＜0.0001)。腎活檢組織切片進行免疫熒光套染，發(fā)現(xiàn)Gadd45β與足細胞特異性的標志物synatopodin，WT-1分布有一致的地方;免疫電鏡發(fā)現(xiàn)Gadd45β在足細胞上表達。
　　 (3) FSGS患者腎小球Gadd45β表達與蛋白尿(r=0.667，p＜0.0001)、血肌酐(r=0.3609，p=0.0

6、028)、甘油三酯(r=0.4527，p=0.0049)正相關，血清白蛋白(r=-0.3713，p=0.0237)負相關。
　　 結論:Gadd45b與足細胞損傷關系密切，腎小球Gadd45β表達上調(diào)介導了蛋白尿的產(chǎn)生。腎小球Gadd45β表達上調(diào)有助于FSGS病情的判斷。
　　 第二部分、探討Gadd45b參與足細胞損傷機制
　　 目的:探討Gadd45b參與足細胞損傷機制。
　　 方法:
　　

7、 (1)用5ng/ml TGF-β干預永生化的人足細胞不同的時間(15min、30min、1h、4h、12h、24 h、36h、48h)，實時定量RT-PCR檢測Gadd45b基因表達，Western blot檢測Gadd45β、細胞內(nèi)信號通路MAPK p38的磷酸化水平、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)以及足細胞裂孔隔膜蛋白CD2AP。實時細胞儀分析TGF-β刺激人足細胞引起細胞指數(shù)的變化，磷脂酰絲

8、氨酸外翻分析（AnnexinⅤ）法檢測細胞凋亡指數(shù)。
　　 (2)質(zhì)粒載體使Gadd45β在人足細胞中過表達以及用shRNA方法使Gadd45β在人足細胞中低表達。TGF-β分別刺激高表達Gadd45β的足細胞、低表達Gadd45β的足細胞以及正常足細胞，然后用磷脂酰絲氨酸外翻分析(AnnexinⅤ)法檢測細胞凋亡指數(shù)。
　　 結果:實時定量RT-PCR結果顯示5ng/ml TGF-β作用足細胞使Gadd45b表達顯著上

9、調(diào)，作用1h最明顯，隨后呈時間依賴性下降，但TGF-β作用48h后仍然高于對照組，Western blot進一步證實了RT-PCR的結果。TGF-β刺激人足細胞24h后出現(xiàn)足細胞裂孔膜蛋白CD2AP表達降低，且48h作用最明顯;TGF-β可激活足細胞p38、cleaved caspase-3。細胞實時分析顯示:TGF-β刺激人足細胞24h后開始出現(xiàn)細胞指數(shù)下降，并隨著時間增加而該效應更加明顯，48h細胞指數(shù)最低。流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)TGF

10、-β刺激人足細胞24h后凋亡開始出現(xiàn)并隨著作用時間的增加而其凋亡率隨著增加。過表達Gadd45β足細胞凋亡明顯增加（過表達組:15.07±1.274％ vs對照組:4.7±1.136％，P＜0.01），TGF-β刺激過表達Gadd45β足細胞凋亡率顯著大于過表達Gadd45β足細胞組（TGF-β刺激過表達組:57.97±2.627％vs過表達組:15.07±1.274％，）。低表達Gadd45β足細胞未見明顯凋亡(低表達組:6.533±