Mir-503調(diào)控破骨細(xì)胞分化及其在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中作用機(jī)制.pdf

1、本研究分為三部分。
　　第一部分絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者破骨前體細(xì)胞microRNA表達(dá)譜改變
　　目的:分離純化絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者和絕經(jīng)后骨量正常婦女的CD14+外周血單核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs)，研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者PBMCs microRNA表達(dá)譜的變化。
　　方法:招募相互匹配的51例絕經(jīng)后中國女性，其中26人確診為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，25例骨量正

2、常。從上述相互匹配的兩組人群中各隨機(jī)抽取5名對(duì)象，以密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞，用免疫磁珠法分選出高純度的CD14+外周血單核細(xì)胞(PBMCs);應(yīng)用microRNA微陣列技術(shù)，對(duì)比絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥組和骨量正常的絕經(jīng)后女性的外周血單核細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的變化。選取表達(dá)顯著下調(diào)的miR-503作為進(jìn)一步研究的對(duì)象。通過實(shí)時(shí)定量PCR(quantitativereverse transcription PCR，qRT-PCR)方法驗(yàn)

3、證MiR-503在所有51名對(duì)象PBMCs中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1)26名符合絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，25名相應(yīng)年齡段的絕經(jīng)后女性的骨密度正常。兩組人群在年齡、體重、血液雌二醇水平方等面均匹配，并且兩組人群在飲食鈣攝入量、絕經(jīng)年限、體育鍛煉、血清完整的甲狀腺激素(parathyroid hormone，PTH)水平、血清25-羥維生素D、血清腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα，TNF-α)等水平均

4、無明顯差異。骨源性堿性磷酸酶(bone-formation marker bone-specific alkaline phosphatase，BAP)在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者中減低(P＜0.05)。(2)通過密度梯度離心法成功從外周血中分離出單核細(xì)胞，采用磁珠分選(magnetic activated cell sorting，MACS)系統(tǒng)分選出高純度的CD14+PBMCs;(3)采用microRNAmicroarray技術(shù)檢測絕經(jīng)后

5、骨質(zhì)疏松癥組和骨量正常組CD14+PBMCs miRNA表達(dá)譜變化，識(shí)別5個(gè)差異表達(dá)的miRNAs——在骨質(zhì)疏松癥患者中hsa-miR-503，hsa-miR-218，hsa-miR-618表達(dá)下調(diào)，而hsa-miR-133a，hsa-miR-107表達(dá)上調(diào)，以hsa-miR-503表達(dá)下調(diào)最為明顯。(4)通過PCR驗(yàn)證miR-503在所有的51名對(duì)象中均有表達(dá)，且表達(dá)模式與miRNA微陣列吻合，即在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥組表達(dá)水平明顯低于骨

6、量正常的絕經(jīng)后女性組。
　　結(jié)論:應(yīng)用microRNA芯片發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者CD14+PBMCs中micorRNA表達(dá)譜的差異，在骨質(zhì)疏松癥患者中Hsa-miR-503，hsa-miR-218，hsa-miR-618表達(dá)下調(diào)，而hsa-miR-133a，hsa-miR-107表達(dá)上調(diào)，其中hsa-miR-503表達(dá)下調(diào)最為明顯。qRT-PCR進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在所有絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥人群中均有miR-503表達(dá)下調(diào)。
　　第二部

7、分 miR-503調(diào)控破骨細(xì)胞分化及其對(duì)去卵巢小鼠骨代謝的影響
　　目的:從細(xì)胞水平研究hsa-miR-503在CD14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化過程中的作用，從動(dòng)物水平研究hsa-miR-503對(duì)骨代謝的影響。
　　方法:細(xì)胞水平，分別以miRNA前體(pre-miR-503)和miRNA阻滯劑(antagomiR-503)轉(zhuǎn)染絕經(jīng)后正常女性的CD14+PBMCs，用Northern Blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中成熟miR-5

8、03的表達(dá)水平，然后用人核因子κB受體活化素配體(human receptor activator of nuclearfactor-κB ligand，hRANKL)和重組人巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human-macrophage colony stimulating factor, rh-MCSF)誘導(dǎo)，使CD14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化，實(shí)時(shí)定量PCR檢測破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NFATc1(Nuclea

9、r factor of activated T-cellscytoplasmic)及具有破骨細(xì)胞特異性的抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP) mRNA水平，TRAP染色觀察破骨細(xì)胞分化情況。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者的CD14+PBMCs中，轉(zhuǎn)染pre-miR-503恢復(fù)miR-503表達(dá)后，誘導(dǎo)CD14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化，實(shí)時(shí)定量PCR檢測破骨細(xì)胞分化指標(biāo)TRAP、

10、NFATc1mRNA水平，行TRAP染色檢測TRAP+的多核巨細(xì)胞數(shù)目。動(dòng)物水平，小鼠分為(Ovariectomy，OVX)手術(shù)組和假手術(shù)組(SHAMgroups)，去卵巢小鼠模擬絕經(jīng)后狀態(tài)，分別用miR-503激動(dòng)劑ago-miR503或miR-503的阻滯劑antagomiR-503實(shí)現(xiàn)活體內(nèi)骨組織miR-503過表達(dá)或表達(dá)受抑，用雙能X線骨密度儀檢測股骨頸骨礦密度（bone mineral density，BMD），MicroCT

11、檢測骨微結(jié)構(gòu)，并通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測TRAP、NFATc1 mRNA水平。
　　結(jié)果:(1)用pSilencer4.1-CMV puro構(gòu)建pre-miR-503(hsa-miR-503的表達(dá)載體)，轉(zhuǎn)染后在PBMCs中高表達(dá)hsa-miR-503;antagomiR-503轉(zhuǎn)染PBMCs后抑制hsa-miR-503表達(dá)。(2)在絕經(jīng)后骨量正常女性的PBMCs中，hsa-miR-503過表達(dá)抑制TRAP+的多核巨細(xì)胞形成，TRA

12、P、NFATc1 mRNA水平下降，相反，在轉(zhuǎn)染antagomiR-503的細(xì)胞中，上述與破骨細(xì)胞分化相關(guān)的指標(biāo)均顯著增加a在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者PBMCs中，恢復(fù)hsa-miR-503能抑制TRAP陽性多核巨細(xì)胞形成形成，降低TRAP、NFATc1 mRNA水平。(3)動(dòng)物模型中ago-mir503可導(dǎo)致小鼠體內(nèi)miR-503過表達(dá)，antagomiR-503導(dǎo)致小鼠體內(nèi)miR-503表達(dá)受抑。(4)動(dòng)物水平，在假手術(shù)組中，過表達(dá)hs

13、a-miR-503可導(dǎo)致骨密度增加，骨微結(jié)構(gòu)改善，抑制hsa-miR-503可導(dǎo)致骨密度減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞。在去卵巢小鼠中恢復(fù)hsa-miR-503表達(dá)可抑制骨吸收，阻止骨丟失。
　　結(jié)論:(1)骨量正常絕經(jīng)后女性CD14+PBMCs中hsa-miR-503過表達(dá)可使CD14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化過程受抑制，而抑制hsa-miR-503表達(dá)后可促進(jìn)CD14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化。迸一步研究發(fā)現(xiàn)，在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者CD1

14、4+PBMCs恢復(fù)miR-503表達(dá)可阻止破骨細(xì)胞分化。(2)動(dòng)物水平抑制hsa-miR-503可導(dǎo)致骨密度減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞。在去卵巢小鼠中恢復(fù)hsa-miR-503表達(dá)可導(dǎo)致骨密度增加，骨微結(jié)構(gòu)改善。
　　第三部分 hsa-miR-503調(diào)控破骨細(xì)胞分化的機(jī)制研究
　　目的:預(yù)測并驗(yàn)證hsa-miR-503的直接有效靶基因，探索hsa-miR-503抑制CD14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化的具體機(jī)制。
　　方法:通過

15、靶基因預(yù)測軟件(RNA22)預(yù)測得到hsa-miR-503作用的可能的靶基因。用M-CSF與RANKL共同誘導(dǎo)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者和絕經(jīng)后骨量正常女性的CD14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化，用Northern blot檢測RNAK mRNA、miR-503水平，Western blot檢測RNAK蛋白水平，比較MiR-503與RANK在破骨細(xì)胞分化中的表達(dá)模式。然后將包含hsa-miR-503結(jié)合位點(diǎn)的靶基因——核轉(zhuǎn)錄因子-κB受體活化因

16、子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)的編碼序列(Coding sequence，CDS)片段克隆到pGL3載體的編碼區(qū)(CDS)，構(gòu)建報(bào)告載體WT-pGL3-RANK（野生型）。用QuickChangesite-directed mutagenesis試劑盒構(gòu)建結(jié)合位點(diǎn)含有突變的報(bào)告載體MUT-pGL3-RANK（突變型）。將這上述載體分別與pre-miR-503或miR-C（對(duì)

17、照）共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞CD14+PBMCs，檢測熒光素酶活性，以證實(shí)RANK是hsa-miR-503作用的直接靶基因。最后，以pre-miR-503和antagomir-503分別轉(zhuǎn)染PBMCs，RT-PCR和Western blot分別檢測RNAK mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化，明確hsa-miR-503對(duì)靶基因的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:(1)靶基因預(yù)測軟件RNA22預(yù)測hsa-miR-503的靶基因?yàn)镽ANK。(2)絕經(jīng)后骨量正常女性

18、的CD14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化時(shí)miR-503輕度上升，RANK mRNA水平明顯上升，RANK蛋白水平增加不明顯;來源于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者的CD14+PBMCs向破骨細(xì)胞分化時(shí)，miR-503基線水平較正常對(duì)照低，而RANK mRNA以及蛋白水平均增加。(3) pre-miR-503和WT-pGL3-RANK（野生型）共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性較對(duì)照組顯著降低，而pre-miR-503和MUT-pGL3-RANK（突變型）共轉(zhuǎn)染的熒

19、光素酶活性較對(duì)照組變化不明顯。(4) pre-miR-503轉(zhuǎn)染CD14+PBMCs可以降低RANK蛋白水平，而對(duì)RANK mRNA水平無影響。用antagomiR-503單獨(dú)轉(zhuǎn)染增加RANK蛋白水平，而對(duì)RANK mRNA水平無影響。因此，hsa-miR-503通過抑制靶基因RANK，使蛋白表達(dá)降低，從而抑制破骨細(xì)胞分化。
　　結(jié)論:(1)通過RNA22靶基因預(yù)測工具并經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)明確RANK為hsa-miR-503作