丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法的建立及臨床應(yīng)用.pdf

1、背景與目的:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)是引起輸血后病毒性非甲非乙型肝炎的主要病原,主要通過(guò)輸血、靜脈吸毒途徑傳播,也可通過(guò)密切接觸和母嬰傳播。目前全世界約有1.7億HCV感染者,預(yù)計(jì)我國(guó)感染者不低于4000萬(wàn)人。受感染者中約有一半可發(fā)展為慢性肝炎,進(jìn)而部分可發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞性肝癌。目前,尚無(wú)有效的丙型肝炎預(yù)防疫苗及治療藥物,因此對(duì)HCV感染的早期診斷是有效控制丙型肝炎病毒傳播的重要手段。目前,HCV感

2、染的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)主要有血清HCV RNA、抗HCV抗體及HCV抗原檢測(cè)。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測(cè)HCV RNA是目前HCV感染診斷最靈敏、最特異的方法,但其操作比較復(fù)雜,易造成污染,且價(jià)格昂貴,不適于大規(guī)模的篩查。HCV感染患者血清中的抗原水平很低,常規(guī)的免疫學(xué)、病毒學(xué)方法難以獲得陽(yáng)性結(jié)果;因此,血清HCV抗原檢測(cè)尚不能作為一種實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)手段?？笻CV檢測(cè)是HCV感染的主要證

3、據(jù)之一。目前,臨床應(yīng)用最多的方法仍是以檢測(cè)血清抗HCV為主,而普遍采用的酶免疫的檢測(cè)方法,對(duì)于低水平人群容易造成漏檢;在國(guó)外化學(xué)發(fā)光法因其靈敏度高,已經(jīng)成為主要的檢測(cè)方法,而國(guó)內(nèi)在化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗HCV上基本還屬于空白。因此,用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗HCV對(duì)進(jìn)一步提高抗HCV檢測(cè)水平有重要意義。本文采用化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(Chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA)的原理檢測(cè)人血清中的抗HCV抗體。<

4、br>　　方法:1、采用改良過(guò)碘酸鈉法將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記到抗人IgG上,并配制成酶標(biāo)抗體工作液:用pH9.6的碳酸鹽緩沖液將丙型肝炎病毒融合抗原(含CORE、NS3、NS4、NS5)包被于化學(xué)發(fā)光微孔板上,并優(yōu)化其最佳工藝;建立抗HCV化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測(cè)體系,確定加樣模式、洗滌方式、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、測(cè)定時(shí)間。2、通過(guò)檢測(cè)國(guó)家和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品,評(píng)價(jià)該方法的靈敏度、特異性等性能指標(biāo);觀察常見(jiàn)的抗凝劑、特殊人群血清等對(duì)本方法測(cè)定性能的影

5、響;并和進(jìn)口ELISA試劑盒進(jìn)行臨床對(duì)照。
　　結(jié)果:1、確立了化學(xué)發(fā)光包被板的包被方法:采用國(guó)產(chǎn)微孔板;包被液和包被方式為0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6),100μl/孔,4℃過(guò)夜,抗原包被濃度為1μg/ml;封閉液為0.01 mol/L PBS(pH7.4,含1％BSA和5％蔗糖),封閉方式為4℃過(guò)夜。建立了抗HCV化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系:100μl樣本稀釋液加10μl樣本,37℃反應(yīng)30min,沈板6次,加1:400

6、0稀釋的酶標(biāo)抗體100μl/孔,37℃反應(yīng)30min,洗板6次,加入發(fā)光底物A、B各25μl,在10~15min內(nèi)檢測(cè)發(fā)光值。2、本方法的分析靈敏度為0.1NCU/ml?？笻Bs陽(yáng)性、抗核抗體陽(yáng)性、多發(fā)性骨髓瘤患者、孕婦及嬰幼兒、抗HIV陽(yáng)性血清對(duì)本方法無(wú)干擾;含膽紅素、膽固醇、甘油三酯血清標(biāo)本在一定范圍內(nèi)不會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響;常用的抗凝劑不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成干擾。本方法在檢測(cè)中國(guó)藥品生物制品檢定所的HCV抗體國(guó)家參考品時(shí),陽(yáng)性檢出率優(yōu)于國(guó)