T淋巴細胞分泌的MIP-1α與人腦微血管內皮細胞膜受體CCR5相互作用：Aβ依賴性促進T淋巴細胞穿過血腦屏障.pdf

1、本文選擇6T-CEM細胞作為AD病人T淋巴細胞的模式細胞，著重探討了MIP-1α-CCR5相互作用在AD病人T淋巴細胞穿過血腦屏障過程中所發(fā)揮的生物學功能，同時通過建立Aβ腦內沉積動物模型，發(fā)現(xiàn)注射至大鼠海馬的Aβ<,1-42>能夠誘導外周血T細胞MIP-1α依賴性進入腦實質，最后通過體外小膠質細胞原代培養(yǎng)對T淋巴細胞和小膠質細胞之間的“交流”進行了初步探討，為進一步研究T淋巴細胞在AD病人腦內發(fā)揮的作用以及對AD的治療提供了理論基礎。

2、 研究方法： 一、探討MIP-1α在T淋巴細胞(6T-CEM)穿過HBMEC單層過程中的作用。 1、細胞培養(yǎng)。 (1)HBMEC細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清，10％Nu血清的RPMI1640培養(yǎng)液。 (2)61-CEM細胞培養(yǎng)于10％新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。 2、免疫熒光技術檢測緊密連接蛋白ZO-1表達。 (1)6T-CEM以時間方式或rhMIP-1α以時間和濃度方式與H

3、BMEC共同孵育后，通過免疫熒光法觀察緊密連接蛋白ZO-1分布。 (2)6T-CEM、MIP-1α中和抗體與HBMEC共同孵育后檢測緊密連接蛋白ZO-1分布。 3、跨內皮遷移實驗分析6T-CEM穿過HBMEC單層能力及HBMEC單層通透性研究。 (1)6T-CEM與不同濃度的rhMIP-1α加入BBB體外模型Transwell上室作用20h后，計數穿過進入Transwell下室的細胞數。 (2)6T-CE

4、M與不同濃度的MIP-1α中和抗體加入BBB體外模型Transwell上室作用20h后，計數穿過進入Transwell下室的細胞數。 (3)Transwell上室中加入相同濃度rhMIP1-α，分別孵育不同時間，或者加入不同濃度的rhMIP-1α孵育6h，測定跨上皮細胞電阻(Trans Epithelial ElectricalResistance，TEER)，然后通過加入辣根過氧化物酶(HRP)進行HRP flux分析。

5、 二、探討HBMEC膜受體CCR5在6T-CEM穿過HBMEC單層過程中的作用 1、應用Western blot方法分析不同處理因素下HBMEC細胞膜上CCR5受體及ROCK激酶表達 (1)6T-CEM與HBMEC分別孵育不同時間后，檢測HBMEC膜受體CCR5表達。 (2)rhMIP-1α以濃度和時間方式與HBMEC作用后，檢測HBMEC膜受體CCR5表達。 (3)rhMIP-1α與HBMEC分別孵育

6、不同時間后，或rhMIP-1α作用于分別經過CCR5中和抗體2D7和ROCK特異性抑制劑Y27632處理的HBMEC后，檢測HBMEC中cofilin磷酸化情況。 (4)Aβ以濃度與時間方式與HBMEC作用后，檢測HBMEC膜受體CCR5表達。 2、真核表達載體構建及穩(wěn)定細胞轉染方法建立高表達CCR5的HBMEC細胞株 (1)重組質粒pUCmT-CCR5的構建 ①以CCR5的基因序列，依據引物設計原則設計

7、引物，PCR擴增HBMEC中CCR5基因片斷。 ②T-A克隆將CCR5基因片段連接到pUCmT載體上，命名為pUCmT-CCR5。 ③將重組質粒pUCmT-CCR5轉化感受態(tài)細菌DH5α，通過藍白篩選，酶切鑒定，驗證插入片段的存在。 ④送交測序，驗證插入片段序列的正確性。 (2)真核表達載體構建 ①提取pUCmT-CCR5 (含有CCR5基因)和Invitrogen公司載體pcDNA3.1/Myc

8、-HisA質粒DNA，將CCR5基因全長(1kb)定向克隆至pcDNA3.1/Myc-HisA，命名為pcDNA3.1/MH-CCR5。 ②雙酶切驗證克隆是否成功，將pcDNA3.1/MH-CCR5送交測序，驗證CCR5基因讀碼框的正確性。 ③利用Qiagen Midi rep質粒DNA中量提取試劑盒，分別提取pcDNA3.1/Myc-HisA和peDNA3.1/MH-CCR5質粒DNA。 (3)穩(wěn)定轉染HBME

9、C細胞 ①利用Fugene<'TM>6 transfection reagent，對HBMEC進行轉染，通過10-14天的G418篩選，挑取單克隆，擴大培養(yǎng)，形成能夠穩(wěn)定傳代的細胞克隆株。 ②利用CCR5的抗體，通過Western blot方法檢測CCR5蛋白的表達，以此來鑒定轉染成功的單克隆細胞株。 3、免疫熒光技術檢測緊密連接蛋白ZO-1表達 6T-CEM與CCR5中和抗體2D7預處理的HBMEC共同

10、孵育后檢測緊密連接蛋白ZO-1分布。 4、跨內皮遷移實驗分析6T-CEM穿過HBMEC單層能力 (1)6T-CEM細胞加入BBB體外模型已形成HBMEC(CCR5+)單層的Transwell上室作用20h后，計數穿過進入Transwell下室的細胞數。 (2)6T-CEM細胞加入到經CCR5中和抗體2D7預處理的BBB體外模型Transwell上室作用20h后，計數穿過進入Transwell下室的細胞數。

11、 5、雙重免疫熒光技術觀察HBMEC膜受體CCR5和MIP-1α的定位 三、探討大鼠腦內Aβ<,1-42>沉積對T細胞遷移入腦的影響 1、Aβ<,1-42>腦內沉積動物模型的建立及標本采集與處理。 (1)制備聚集態(tài)Aβ<,1-42>和Aβ<,42-1>，通過立體定位儀將Aβ<,1-42>注射到Wistar大鼠雙側海馬，對照組注射等體積Aβ<,42-1>和PBS。 (2)標本采集與處理。 ①心臟采血

12、，肝素抗凝。 ②經左心室依次灌注生理鹽水和4％多聚甲醛，立即取腦。 ③腦組織經后固定和蔗糖溶液浸泡，冰凍切片機上行冠狀切片，片厚10μm。 ④通過NycoPrep<'TM> 1.077 A and MagCellect Rat CD3+T細胞分離試劑按照產品說明書操作規(guī)程從肝素化的大鼠全血中分離T淋巴細胞。 ⑤Trizol提取大鼠T細胞總RNA并反轉錄成cDNA。 2、雙重免疫熒光技術觀察Aβ<,

13、1-42>沉積對腦微血管內皮細胞膜受體CCR5表達及T細胞穿過血腦屏障的影響。 (1)利用vwF和CCR5的抗體，通過雙重免疫熒光技術觀察腦微血管內皮細胞膜受體CCR5表達。 (2)利用CD3抗體，通過免疫熒光技術觀察腦內T細胞分布。 (3)大鼠腹腔注射MIP-1α的中和抗體，觀察阻斷MIP-1α的效應對T細胞穿過血腦屏障的影響。 3、半定量PCR方法檢測Ap<,1-42>腦內沉積大鼠T淋巴細胞MIP-1

14、α表達情況。 研究結果： 1、T淋巴細胞分泌的MIP-1β促使其穿過HBMEC單層能力增強(1)表達MIP-1β的T淋巴細胞(6T-CEM細胞)或rhMIP-1α與HBMEC相互作用后，引起HBMEC間的緊密連接結構紊亂。 (2)rhMIP-1α能夠促使6T-CEM穿過HBMEC單層能力增強，而經過MIP-1α中和抗體處理或針對MIP-1αsiRNA干擾后的6T-CEM穿過HBMEC單層能力降低，同時緊密連接結構

15、基本保持完整。 2、HBMEC膜受體CCR5介導了T淋巴細胞穿過HBMEC單層過程。 (1)6T-CEM或rhMIP-1α與HBMEC相互作用，均引起HBMEC膜受體CCR5表達升高。 (2)成功構建真核表達載體pcDNA3.1/Myc-HisA-CCR5及穩(wěn)定表達CCR5基因的HBMEC細胞克隆株。 (3)6T-CEM穿過高表達CCR5的HBMEC單層能力增強，而加入CCR5中和抗體2D7后，6T-CE

16、M穿過HBMEC單層能力降低，并且緊密連接結構基本保持完整。 (4)rhMIP-1α能夠與HBMEC細胞膜上的CCR5配體．受體共定位。 (5)MIP-1α-CCR5相互作用通過ROCK信號途徑引起緊密連接紊亂。 3、大鼠腦內Aβ<,1-42>沉積誘導T淋巴細胞MIP-1α依賴性遷移入腦。 (1)Aβ<,1-42>能夠上調HBMEC細胞膜上CCR5受體表達。 (2)成功制備Aβ<,1-42>在腦內

17、沉積的動物模型。 (3)并且在腦內沉積的模型動物中Aβ<,1-42>沉積也能夠誘導外周血T淋巴細胞MIP-1α和腦內皮細胞上CCR5表達升高，最終引起外周血T細胞MIP-1α依賴性穿過血腦屏障。 研究結論： 1、T淋巴細胞分泌的MIP-1α與HBMEC細胞膜上的CCR5受體相互作用，通過激活HBMEC細胞中ROCK信號通路引起緊密連接結構紊亂，導致緊密連接開放，使T淋巴細胞穿過HBMEC單層能力增強。 2