BMP2對H9c2心肌細胞組蛋白乙?；揎椀恼{(diào)控作用及其機制研究.pdf

1、本文從以下幾方面進行了詳細闡述。
　　第一部分:BMP2對H9c2心肌細胞心臟核心轉(zhuǎn)錄因子表達及組蛋白乙?；揎椀恼{(diào)控作用。
　　目的：
　　構(gòu)建BMP2過表達的心肌細胞模型，檢測BMP2對心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C和Tbx5表達的影響，并研究BMP2對H9c2心肌細胞總組蛋白H3、基因啟動子區(qū)組蛋白H3乙?；揎椉敖M蛋白乙?；?HATs)亞型p300和GCN5的調(diào)控作用，以證實我們的科學假設:BMP2是

2、心肌細胞組蛋白乙?；揎椀纳嫌涡盘柾分?。
　　方法：
　　(1)過表達BMP2的腺病毒(AdBMP2)及對照空腺病毒(AdGFP)在HEK293細胞中擴增后，分別以不同滴度轉(zhuǎn)染大鼠H9c2心肌細胞，24h后熒光倒置顯微鏡下觀察AdBMP2/AdGFP腺病毒轉(zhuǎn)染細胞綠色熒光蛋白的表達情況，流式細胞術檢測AdBMP2/AdGFP腺病毒轉(zhuǎn)染效率。
　　(2) AdBMP2/AdGFP腺病毒轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞24h、48

3、h和72h后收集細胞，提取mRNA，Real-Time qRT-PCR檢測各處理組細胞BMP2、MEF2C、GATA4和Tbx5及HATs亞型p300和GCN5的mRNA表達水平，篩選最佳干預時間。
　　(3) AdBMP2/AdGFP腺病毒轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞48h后收集細胞，比色法檢測各處理組H9c2心肌細胞核蛋白HATs活性，Western-blotting檢測各處理組細胞總組蛋白H3的乙酰化水平，ChIP-Real-Tim

4、e qPCR檢測各處理組細胞MEF2C、GATA4和Tbx5啟動子區(qū)組蛋白H3乙?；健?br>　　結(jié)果：
　　(1) AdBMP2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞24h后，熒光倒置顯微鏡下可見細胞中出現(xiàn)大量綠色熒光，流式細胞術檢測結(jié)果顯示AdBMP2轉(zhuǎn)染效率可達90％以上。
　　(2) AdBMP2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞24h、48h、72h后，BMP2及心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2C和GATA4的mRNA表達水平較對照組明顯升高(P＜0

5、.05)，并于轉(zhuǎn)染后48h達到高峰，而Tbx5的表達沒有明顯變化。
　　(3) AdBMP2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞48h后，HATs亞型p300的mRNA表達水平較對照組升高(P＜0.05)，而GCN5的表達水平與對照組相比沒有明顯的變化。
　　(4) AdBMP2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞48h后，細胞核蛋白HATs活性較對照組明顯升高(P＜0.05)，總組蛋白H3乙?；揭草^對照組明顯上調(diào)(P＜0.05)，MEF2C、GATA

6、4啟動子區(qū)組蛋白H3乙?；揭嘞鄳撸≒＜0.05），但Tbx5啟動子區(qū)組蛋白H3乙?；脚c對照組相比未見明顯變化。
　　結(jié)論：
　　(1) BMP2可上調(diào)H9c2心肌細胞中心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2C和GATA4的表達，而對Tbx5的表達沒有影響。
　　(2) BMP2可引起H9c2心肌細胞組蛋白H3高乙?；赡苁荋9c2心肌細胞組蛋白乙?；揎椀纳嫌涡盘柾分弧?br>　　(3) BMP2引起的H9c2心肌

7、細胞組蛋白H3高乙?；赡芘cHATs亞型p300有關。
　　(4) BMP2對MEF2C和GATA4啟動子區(qū)組蛋白H3乙?；拇龠M作用可能是BMP2引起MEF2C和GATA4表達上調(diào)的機制之一，而Tbx5啟動子區(qū)組蛋白H3乙?；词蹷MP2的影響可能是Tbx5的表達不受BMP2調(diào)控的原因之一。
　　第二部分:p300參與BMP2對H9c2心肌細胞心臟核心轉(zhuǎn)錄因子表達及組蛋白乙?；揎椀恼{(diào)控作用。
　　目的：
　　

8、使用HATs亞型p300的抑制劑姜黃素(Curcumin)來研究p300在BMP2致H9c2心肌細胞心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4和MEF2C高表達及組蛋白高乙?；械淖饔?，以證實我們的科學假設:p300參與BMP2對H9c2心肌細胞心臟核心轉(zhuǎn)錄因子表達及組蛋白乙酰化修飾的調(diào)控作用。
　　方法：
　　(1) AdBMP2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞后，用不同濃度的p300 HAT活性抑制劑姜黃素(10μM，20μM，30μM，40μM)

9、處理細胞(6h，12h，24h，48h)，比色法檢測各處理組細胞HATs活性，篩選姜黃素最佳處理濃度及時間。
　　(2) AdBMP2和/或姜黃素處理H9c2心肌細胞后，Real-Time qRT-PCR檢測各處理組細胞心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C和Tbx5及HATs亞型p300和GCN5的表達水平，Western-blotting檢測各處理組細胞總組蛋白H3的乙酰化水平，ChIP-Real-Time qPCR檢測各處理

10、組細胞GATA4、MEF2C和Tbx5啟動子區(qū)組蛋白H3乙?；健?br>　　結(jié)果：
　　(1)不同濃度(10μM，20μM，30μM，40μM)的姜黃素處理細胞24h后，H9c2心肌細胞的HATs活性明顯下降(P＜0.05)，并于40μM達到最低點。40μM姜黃素分別處理細胞6h，12h，24h，48h后，HATs活性于處理后12h達到最低點。
　　(2) AdBMP2和姜黃素共同處理H9c2心肌細胞后，心臟核心轉(zhuǎn)錄因子

11、GATA4和MEF2C及HATs亞型p300的mRNA表達水平較單獨AdBMP2處理組明顯下降（P＜0.05），而Tbx5及GCN5的mRNA表達水平在各處理組之間沒有明顯的變化。
　　(3) AdBMP2與姜黃素共同處理H9c2心肌細胞后，細胞中總組蛋白H3乙?；郊癎ATA4和MEF2C啟動子區(qū)組蛋白H3乙?；捷^單獨AdBMP2處理組明顯下降(P＜0.05)，而Tbx5啟動子區(qū)組蛋白H3乙?；诟魈幚斫M之間沒有明顯的變化

12、。
　　結(jié)論：
　　(1)姜黃素可抑制HATs亞型p300的表達，而對GCN5的表達沒有影響。
　　(2)在H9c2心肌細胞中，p300 HAT活性抑制劑姜黃素可拮抗BMP2引起的組蛋白H3高乙酰化及GATA4和MEF2C的高表達，說明p300參與BMP2對H9c2心肌細胞GATA4和MEF2C表達及組蛋白乙?；恼{(diào)控。
　　(3)在H9c2心肌細胞中，Tbx5啟動子區(qū)組蛋白H3乙?；捌浔磉_可能不受p300的調(diào)

13、控。
　　第三部分:BMPs參與介導氧化應激反應所致H9c2心肌細胞組蛋白高乙?；饔?。
　　目的：
　　使用BMPs信號通路抑制劑dorsomorphin(DM)來研究BMPs在氧化應激反應所致H9c2心肌細胞組蛋白高乙?；械淖饔?，以證實我們的科學假設:BMPs參與介導氧化應激反應所致H9c2心肌細胞組蛋白高乙酰化。
　　方法：
　　(1)不同濃度H2O2(50μM、100μM、150μM、200μM、

14、250μM、300μM、350μM、400μM)處理H9c2心肌細胞，24h后采用MTT法檢測各處理組細胞的存活率。
　　(2)5μM的BMPs信號通路抑制劑DM和/或適宜濃度的H2O2處理細胞，Real-Time qRT-PCR檢測各處理組細胞BMP2及心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4，MEF2C和Tbx5的表達水平，Western-blotting檢測各處理組細胞總組蛋白H3的乙?；?。
　　結(jié)果：
　　(1)50、1

15、00和150μM濃度的H2O2對H9c2心肌細胞的存活率沒有明顯的影響，200、250、300、350、400和450μM濃度的H2O2處理H9c2心肌細胞后，細胞的存活率分別降低10.5％、16.9％、21.9％、32.4％、47.0％和58.6％。
　　(2)400μM H2O2處理H9c2心肌細胞后，BMP2、GATA4、MEF2C和Tbx5的mRNA表達水平較空白對照組明顯升高(P＜0.05)，細胞組蛋白H3的乙酰化水平亦

16、相應升高（P＜0.05）。
　　(3)400μM H2O2和DM共同處理H9c2心肌細胞后，H9c2心肌細胞中總組蛋白H3乙?；捷^單獨400μM H2O2處理組有所下降(P＜0.05)，GATA4和Tbx5的mRNA表達水平也較單獨400μM H2O2處理組有所降低(P＜0.05)，而MEF2C的mRNA表達水平較單獨400μM H2O2處理組有所升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)利用H2O2成功構(gòu)建H

17、9c2心肌細胞氧化損傷模型。
　　(2)400μM H2O2引起的氧化應激可上調(diào)H9c2心肌細胞BMP2、GATA4、MEF2C和Tbx5的表達并引起細胞組蛋白H3高乙酰化。
　　(3) BMPs信號通路抑制劑DM對400μM H2O2引起的氧化應激所致H9c2心肌細胞組蛋白H3高乙?；癎ATA4和Tbx5表達上調(diào)具有一定的拮抗作用，說明BMPs（BMP2及其它BMPs亞型）參與介導氧化應激引起的心肌細胞組蛋白高乙?；癎